目的:探究不同烟草暴露程度健康人群的肠道菌群是否存在差异,挖掘烟草暴露对肠道菌群的影响。方法:收集符合纳入标准的各组人员的粪便样本,其中烟草暴露组(>400年支) (A组) 17例、烟草暴露组(<400年支) (B组) 16例、长期二手烟暴露组(C组) 16例、戒烟组(戒烟6月以上) (D组) 14例及无烟草暴露组(E组) 17例。对上述每份粪便样本进行16S rDNA高通量测序,随后进行OTU分析及物种注释、样本复杂度分析、多样本比较分析及组间群落结构差异显著性分析。结果:A组、B组、D组在菌种组成更为接近,而C组、E组在菌种组成上更为接近。但各组间菌群丰富度、多样性、群落分布无显著异常。在门水平上,部分组间在厚壁菌门(Firmicutes)及变形菌门(Proteobacteria)存在差异(p < 0.05)。在属水平上,Agathobacter属、Blautia属、f_Lachnospiraceae_Unclassified属、Roseburia属、Subdoligranulum属在不同组间存在统计学差异(p < 0.05)。结论:不同程度的烟草暴露人群的肠道菌群多样性未发现明确的差异,但Blautia菌属及Roseburia菌属与烟草暴露程度呈负相关性,值得进一步研究。 Objective: To investigate whether there are differences in the intestinal flora of healthy people with different levels of tobacco exposure, and explore the effects of tobacco exposure on the intestinal flora. Methods: Fecal samples were collected from 80 volunteers, including 17 cases in the tobacco exposure group (Smoking Index > 400) (group A), 16 cases in the tobacco exposure group (Smoking Index < 400) (group B), 16 cases in the long-term second-hand smoke exposure group (group C), 14 cases in the smoking cessation group (more than 6 months) (group D) and 17 cases in the non-tobacco exposure group (group E). Each of the above fecal samples was analyzed by 16SrDNA, and OTU analysis and species annotation, Alpha diversity, Beta diversity, significance analysis of community structure differences were performed between groups. Results: Groups A, B and D were closer in intestinal flora composition, while groups C and E were closer in composition. There were no significant abnormalities in the richness, diversity and community distribution of the intestinal flora between the groups. At the Phylum level,there were significantly differences between the some groups of Firmicutes and Proteobacteria (p < 0.05). At the Genus level, there were significantly differences between the different groups ofAgathobacter,Blautia, f_Lachnospi- raceae_Unclassified,Roseburia, and Subdoligranulum (p < 0.05). Conclusions: Despite there were no clear differences were found in the diversity of intestinal flora in people with different levels of tobacco exposure so far, but the genusBlautiaandRoseburiawere inversely correlated with tobacco exposure, which is worth further exploring.
目的:探究不同烟草暴露程度健康人群的肠道菌群是否存在差异,挖掘烟草暴露对肠道菌群的影响。方法:收集符合纳入标准的各组人员的粪便样本,其中烟草暴露组(>400年支) (A组) 17例、烟草暴露组(<400年支) (B组) 16例、长期二手烟暴露组(C组) 16例、戒烟组(戒烟6月以上) (D组) 14例及无烟草暴露组(E组) 17例。对上述每份粪便样本进行16S rDNA高通量测序,随后进行OTU分析及物种注释、样本复杂度分析、多样本比较分析及组间群落结构差异显著性分析。结果:A组、B组、D组在菌种组成更为接近,而C组、E组在菌种组成上更为接近。但各组间菌群丰富度、多样性、群落分布无显著异常。在门水平上,部分组间在厚壁菌门(Firmicutes)及变形菌门(Proteobacteria)存在差异(p < 0.05)。在属水平上,Agathobacter属、Blautia属、f_Lachnospiraceae_Unclassified属、Roseburia属、Subdoligranulum属在不同组间存在统计学差异(p < 0.05)。结论:不同程度的烟草暴露人群的肠道菌群多样性未发现明确的差异,但Blautia菌属及Roseburia菌属与烟草暴露程度呈负相关性,值得进一步研究。
烟草暴露,肠道菌群,16S rDNA,Blautia菌属,Roseburia菌属
Wen Wu1, Tianxiang Zhou2*, Huiying Huai2, Xiaoshuai Liu2, Ke Qin2, Zhenfeng Miao2, Yi Zhao2, Yumiao Chen2
1Department of Oncology, The Third People’s Hospital of Jiangyin, Jiangyin Jiangsu
2Department of Gastroenterology, The Third People’s Hospital of Jiangyin, Jiangyin Jiangsu
Received: Apr. 2nd, 2023; accepted: Jun. 6th, 2023; published: Jun. 15th, 2023
Objective: To investigate whether there are differences in the intestinal flora of healthy people with different levels of tobacco exposure, and explore the effects of tobacco exposure on the intestinal flora. Methods: Fecal samples were collected from 80 volunteers, including 17 cases in the tobacco exposure group (Smoking Index > 400) (group A), 16 cases in the tobacco exposure group (Smoking Index < 400) (group B), 16 cases in the long-term second-hand smoke exposure group (group C), 14 cases in the smoking cessation group (more than 6 months) (group D) and 17 cases in the non-tobacco exposure group (group E). Each of the above fecal samples was analyzed by 16SrDNA, and OTU analysis and species annotation, Alpha diversity, Beta diversity, significance analysis of community structure differences were performed between groups. Results: Groups A, B and D were closer in intestinal flora composition, while groups C and E were closer in composition. There were no significant abnormalities in the richness, diversity and community distribution of the intestinal flora between the groups. At the Phylum level,there were significantly differences between the some groups of Firmicutes and Proteobacteria (p < 0.05). At the Genus level, there were significantly differences between the different groups of Agathobacter, Blautia, f_Lachnospiraceae_Unclassified, Roseburia, and Subdoligranulum (p < 0.05). Conclusions: Despite there were no clear differences were found in the diversity of intestinal flora in people with different levels of tobacco exposure so far, but the genus Blautia and Roseburia were inversely correlated with tobacco exposure, which is worth further exploring.
Keywords:Tobacco Exposure, Intestinal Flora, 16S rDNA, Blautia, Roseburia
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在全球范围内,吸烟引起的各种健康问题,已经成为人类共同面对的重大挑战。目前研究发现 [
于2021年01月~2021年06月在江苏省江阴市面向社会招募志愿者80名。按烟草暴露情况分为5组,分别为:A组吸烟 > 400年支,共17人(均为男性),年龄32~57岁,平均年龄43.47 ± 8.917岁;B组吸烟 < 400年支,共16人(男性14人,女性2人),年龄29~57岁,平均年龄43.63 ± 9.493岁;C组长期二手烟暴露,共16人(男性0人,女性16人),年龄24~57岁,平均年龄44.38 ± 11.88岁;D组戒烟6月以上,共14人(均为男性),年龄28~59岁,平均年龄47.36 ± 10.49岁;E组无烟草暴露,共17人(男性8人,女性9人),年龄23~57岁,平均年龄38.06 ± 11.74岁;年龄资料为计数资料,经方差分析,各组年龄总体均数无统计学差异(F = 1.606, p = 0.181) (见表1);性别资料为定性资料,各组间经卡方检验,各组间性别存在统计学差异(χ2= 53.23, p < 0.0001) (见表2),但众所周知,我国目前吸烟人群仍以男性群体为主,目前尚无针对不同性别健康人群肠道菌群差异的研究。纳入标准:a) 年龄18~60周岁;b) 民族:汉族;c) 18.5 ≤ BMI < 25 Kg/m2;排除标准:a) 存在明确的肠道菌群相关疾病;b) 3月内使用抗菌药物及益生菌制剂;c) 长期酗酒;d) 长期服用糖皮质激素、免疫抑制剂及滥用药物。本实验获得江阴市第三人民医院伦理委员会批准,所有受试对象均知情同意。
组别 | 例数 | 年龄 | F | p |
---|---|---|---|---|
A | 17 | 43.47 ± 8.917 | 1.606 | 0.181 |
B | 16 | 43.63 ± 9.493 | ||
C | 16 | 44.38 ± 11.88 | ||
D | 14 | 47.36 ± 10.49 | ||
E | 17 | 38.06 ± 11.74 |
表1. 各组间年龄情况比较
组别 | 男性 | 女性 | χ2 | p |
---|---|---|---|---|
A | 17 | 0 | 53.23 | <0.0001 |
B | 14 | 2 | ||
C | 0 | 16 | ||
D | 14 | 0 | ||
E | 8 | 9 |
表2. 各组间性别情况比较
a) 所有志愿者于06:00~08:00用粪便采集管收集新鲜粪便标本3 g左右,随即由专人将标本置于−80℃冰箱保存。DNA提取/QC使用DNA提取试剂盒从样本中提取DNA,使用Equalbit dsDNA HS Assay Kit检测DNA浓度。PCR扩增及文库构建 以20~30 ng DNA为模板,使用PCR引物扩增原核生物16S rDNA上包括V3及V4的2个高度可变区。然后再通过PCR向16S rDNA的PCR产物末端加上带有Index的接头,以便进行NGS测序,用磁珠进行文库纯化后通过酶标仪检测浓度和琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。上机测序 通过酶标仪检测文库浓度。将文库定量到10 nmol/L,按Illumina MiSeq/Novaseq (Illumina, San Diego, CA, USA)仪器使用说明书进行PE250/FE300双端测序,由MiSeq/Novaseq自带的MiSeq Control Software (MCS)/Novaseq Control Software (NCS)读取序列信息。数据分析 双端测序得到的正反向reads首先进行两两拼接,过滤拼接结果中含有N的序列,保留序列长度大于200 bp的序列。经过质量过滤,去除嵌合体序列,最终得到的序列用于OTU聚类,使用VSEARCH (1.9.6)进行序列聚类(序列相似性设为97%),比对的16S rRNA参考数据库是Silva 138。然后利用RDP classifier (Ribosomal Database Program )贝叶斯算法对OTU的代表性序列进行物种分类学分析,并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。再对样本进行OTU分析、样品多样性分析、物种注释、样品组间显 著性差异分析及LEfSe分析。b) 对80位志愿者粪便样本进行Illumina MiSeq测序,得到双端序列数据,将两条序列进行比对,根据比对的末端重叠区进行拼接,拼接时保证至少有20 bp的重叠区,去除拼接结果中含有N的序列;去除引物和接头序列,去除两端质量值低于20的碱基,去除长度小于200 bp的序列;将上面拼接过滤后的序列与数据库进行比对,去除其中的嵌合体序列(chimera sequence),得到最终的有效数据。c) 对以上优化后的有效序列提取unique序列,保留各序列的重复次数,去除重复次数为1的unique序列;按照97%相似性对unique序列(重复次数 > 1)进行OTU聚类,在聚类过程中进一步去除嵌合体序列,得到OTU的代表序列。将所有优化后的序列与OTU代表序列进行比对,与OTU代表序列相似性在97%以上的序列为同一OTU,统计生成OTU丰度表。对样本进行OTU分析以及物种注释。然后通过α多样性分析比较不同组间肠道菌群多样性及丰度差异,主要从ACE、Chaos、Shannon及Simpson指数反映肠道菌群丰富度及多样性。对各组进行Kruskal-Wallis检验,分析组间物种多样性差异是否显著。利用β多样性分析方法进一步阐述烟草暴露对健康人群肠道菌群分布的影响。最后分别在门、属水平上进行各组间成分差异分析。
使用R(3.6.3)进行数据统计分析及绘图。Qiime(1.9.1)采用对序列进行随机抽样,以进行OTU分析,并分别计算各α多样性指数(ACE、Chao1、Shannon、Simpson、goods Coverage),采取Kruskal-Wallis检验进行分析组间物种多样性差异是否显著;基于OTU分析结果绘制Rank-Abundance曲线;基于Brary-Curtis距离矩阵进行PCoA作图分析;基于Beta多样性距离矩阵,进行NMDS分析;借助线上工具 (http://metastats.cbcb.umd.edu/)在属水平上进行Metastats分析。p值 < 0.05认为具有统计意义。
最终共获得5,825,413条优化后有效序列,平均长度为450.21025 bp,主要集中在420~470 bp之间(见图1)。
根据OTU丰度,绘制热图(丰度最高的30个OTU) (见图2)及韦恩图(见图3)。可见有烟草暴露者(A组、B组、C组、D组)特有OTU数(306个、284个、248个、230个)均较无烟草暴露者(E组) 375个减少。根据OTU丰度结果,与Silva数据库比对后可得到各水平下的菌种分布,在门及属水平上绘制物种分布柱状图及热图(见图4、图5)。可见A组、B组、D组在菌种组成更为接近,而C组、E组在菌种组成上更为接近。
图1. 有效序列长度分布统计
图2. OTU丰度聚类热图
图3. OTU韦恩图
图4. 物种分布柱状图((A) 门水平;(B) 属水平)
图5. 物种分布热图((A) 门水平;(B) 属水平)
各组间ACE、Chaos、Shannon及Simpson指数结果如图(见图6)所示。各组间肠道菌群的丰富度、多样性均无显著差异。ns,p ≥ 0.05;*,p < 0.05;**,p < 0.01;***,p < 0.001。
图6. 在属水平上的α多样性分析(ns, p ≥ 0.05;*, p < 0.05;**, p < 0.01;***, p < 0.001)
利用β多样性分析方法进一步阐述烟草暴露对健康人群肠道菌群分布的影响。基于Brary-Crtis距离矩阵通过PCoA (见图7(A))和NMDS (见图7(B))对β多样性进行分析,五组间肠道菌群群落分布无显著异常。
图7. 组间β多样性分析
在门水平上发现,部分组间在厚壁菌门(Firmicutes)及变形菌门(Proteobacteria)存在差异(见图8)。其中B组与C组、A + B混合组与C组、A + B混合组与C+E混合组、C组与A + B + D混合组、A + B + D混合组与C + E混合组间厚壁菌门丰度存在统计学差异,可见不论目前仍在吸烟或已戒烟,直接烟草暴露均会导致肠道内厚壁菌门丰度减少;在A组与C组、C组与D组、A+B混合组与C组、C组与A + B + D混合组、A + B + D混合组与C + E混合组间变形菌门丰度存在统计学差异,不论目前仍在吸烟或已戒烟,直接烟草暴露均会导致肠道内变形菌门丰度增加。ns,p ≥ 0.05;*,p < 0.05;**,p < 0.01;***,p < 0.001。
图8. 门水平菌群组成比较(丰度占比前五)
在属水平上,对各组平均相对丰度大于0.01的菌属,借助Metastats进行差异性分析。相较于A组,C组中显著升高的菌属是罕见小球菌属(Subdoligranulum, p = 0.034);显著下降的菌属有f__Lachnospiraceae_Unclassified (p = 0.024)相较于A组,D组中显著升高的菌属是布劳特氏菌属(Blautia, p = 0.017);无显著下降的菌属。相较于A组,E组中显著升高的菌属是布劳特氏菌属(Blautia, p = 0.013)、Agathobacter菌属(p = 0.025);无显著下降的菌属。相较于B组,D组中显著升高的菌属是布劳特氏菌属(Blautia, p = 0.039);显著下降的菌属有罗氏菌属(Roseburia, p = 0.003)。相较于B组,E组中显著升高的菌属是布劳特氏菌属(Blautia, p = 0.034)、Agathobacter菌属(p = 0.041);无显著下降的菌属。相较于C组,D组中显著下降的菌属有罗氏菌属(Roseburia, p = 0.001)、Agathobacter菌属(p = 0.006);无显著升高的菌属。相较于D组,E组中显著升高的菌属是Agathobacter菌属(p = 0.001)、罗氏菌属(Roseburia, p = 0.012);无显著下降菌属。其中A组与B组间、B组与C组间、C组与E组间,均无显著差异菌属。
越来越多的研究证明,以细菌为主的肠道微生物,在人体的生理及病理进程中发挥着至关重要的作用。本实验通过16S rDNA检测技术对不同烟草暴露程度人群的粪便进行分析,发现在肠道菌群组成上,直接烟草暴露与间接或无烟草暴露者存在差异,但在菌群的多样性及丰富度上并无显著差异,群落分布特征亦无显著差异。但在各组间,Blautia菌属及Roseburia菌属存在差异,且与烟草暴露存程度存在相关性。
本研究发现,相较于吸烟者,戒烟者、不吸烟者的Blautia菌属丰度显著升高。Blautia属毛螺菌属科,目前研究认为其具有减轻炎症反应、改善代谢疾病及对特定微生物的抗菌活性等特性 [
作为核心菌属,Blautia对宿主的生理功能失调,如肥胖、糖尿病、癌症及各种炎症性疾病有显著相关性。Blautia菌属可产生NRPs、PKs、赛克肽类、羊毛硫肽类、细菌素、β-丙内酯等次级产物。一项日本的横断面研究显示,Blautia的丰度与内脏脂肪堆积呈明显的负相关性 [
本研究发现,戒烟者的Roseburia菌属丰度显著低于不吸烟者、二手烟以及低剂量烟草暴露者(<400年支)。Roseburia菌属包括Roseburia intestinalis,R. hominis,R. inulinivorans,R. faecis和R. cecicola等5种革兰氏阳性杆菌。目前研究认为,其具有代谢饮食成分,产生短链脂肪酸,特别是丁酸盐,从而影响结肠运动、免疫维持以及抗炎特性。新生儿体内并无Roseburia菌属定植,人类体内的Roseburia可能源自母乳 [
于君等人研究发现 [
在本实验中,通过16S rDNA检测,并未发现不同烟草暴露程度人群存在显著的肠道菌群组成差异,菌群的多样性及丰富度上亦无显著差异,但在属水平上发现,Blautia菌属及Roseburia菌属丰度在更多烟草暴露人群普遍低于更少的烟草暴露人群。Blautia菌属及Roseburia菌属均通过其代谢产物对宿主肠道及免疫系统进行干预。进一步通过多组学联合,探究Blautia及Roseburia菌属在宿主体内的代谢产物及作用机制,可以为研究烟草相关疾病发病机制、治疗手段提供新的思路。
吴 雯,周天翔,怀惠英,柳晓帅,秦 科,缪振丰,赵 轶,陈育苗. 烟草暴露与人类肠道菌群相关性探究Exploring the Correlation between Tobacco Exposure and Human Intestinal Flora[J]. 微生物前沿, 2023, 12(02): 71-82. https://doi.org/10.12677/AMB.2023.122009
https://doi.org/10.1126/sciadv.aap8368
https://doi.org/10.1177/2047487319883557
https://doi.org/10.21037/tlcr-22-27
https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00224
https://doi.org/10.1038/s41467-018-05884-0
https://doi.org/10.3390/jcm7090282
https://doi.org/10.1186/s40168-018-0531-3
https://doi.org/10.1007/s12088-018-0746-9
https://doi.org/10.1080/19490976.2021.1875796
https://doi.org/10.1021/jf504074n
https://doi.org/10.1021/acs.jafc.7b00943
https://doi.org/10.1021/jf403924c
https://doi.org/10.2147/CEG.S186097
https://doi.org/10.1038/s41522-019-0101-x
https://doi.org/10.1007/s10620-016-4179-1
https://doi.org/10.1002/ijc.32339
https://doi.org/10.1038/ncomms2852
https://doi.org/10.1038/s41588-018-0224-7
https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02369
https://doi.org/10.7150/ijbs.35980
https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00118
https://doi.org/10.1007/s00535-017-1384-4
https://doi.org/10.3390/ijms20225751
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