Hans Journal of Chemical
Engineering and Technology 化学工程与技术, 2013, 3, 142-147
http://dx.doi.org/10.12677/hjcet.2013.34026
Published Online July 2013 (http:
//www.abtbus.com/journal/hjcet.html)
The Application of High Performance Liquid
Chromatography-Mass Spectrometry Analysis
of Heterocyclic Compounds
You Li
Pharmaron (Beijing) Co. Ltd, Beijing
Email: liyou511@hotmail.com
Received: May 9
th
, 2013; revised: May 30th, 2013; accepted: Jun. 7th, 2013
Copyright © 2013 You Li. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permi
ts unrestricted use,
distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract:
High performance liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) technology is widely applied in many
areas. Chemical production of many organic compounds can be analyzed by liquid chromatography and mass spec-
trometry can provide structural information of the substance. LC-MS is used in many new types of compounds analysis.
This paper first introduces the basic principles and the develop ment of LC-MS; then heterocyclic organic qualitative re-
search of the API for the detection of
chemical production and the problems encountered are introduced, and mainly
discusses retention time control and trailing factors improvement. Specific studies and the results are as follows: 1) Im-
prove chromatographic retention of polar compounds; 2)
Peak tailing factor improvement; 3) Study of the chroma-
tographic separation methods.
Keywords:
High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry; Chromatograph ic Separation; Tailing
Factor
高效液相色谱–质谱联用技术在杂环化合物分析中的应用
李
柚
康龙化成
(北京
)新药技术有限公司，北京
Email: liyou511@hotmail.com
收稿日期：
2013
年5月9日；修回日期：2013 年5月30 日；录用日期：2013 年6月7日
摘
要：
高效液相色谱–质谱联用
(LC-MS)
技术的应用领域极为广阔，化工生产中许多有机物可以用液相色谱
法来进行分析，而质谱能够提供物质的结构信息，应用于许多新类型化合物的分析。本文首先介绍了
LC-MS 联
用的基本原理以及发展情况；之后针对原料药化工生产中的检测和遇到的问题介绍了杂环类有机物的定性研究，
主要针对保留时间的控制和拖尾因子的改善方法作出讨论。具体研究内容及成果如下：
1) 提高大极性化合物的
色谱保留性；
2) 色谱峰拖尾因子的改善；
3) 色谱分离方法的研究。
关键词：
高效液相色谱–质谱联用；色谱分离；拖尾因子
1.
引言
液质联用
(HPLC-MS)
又叫液相色谱–质谱联用
技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。
样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱
的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得
到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，
将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱具有高选择
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142
高效液相色谱–质谱联用技术在杂环化合物分析中的应用
性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的
优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等
许多领域得到了广泛的应用。
LC
和
MS 的联用，使
得液相色谱可以获得比紫外检测更多的信息。
HPLC
可以直接分离不挥发性化合物、极性化合物和大分子
化合物
(
包括蛋白质、多肽、多糖和多聚物等)；MS
灵敏度高，样品用量少，分析速度快，可得到更多的
化合物的结构信息。目前先进的质谱仪，还同时具备
了分析分子结构的能力，即通过应用母离子扫描、子
离子扫描、中性丢失等先进技术，对待测样品的结构
进行分析判定
[1,2]
。
近年来，液相色谱–质谱联用在技术及应用方面
取得了很大进展，在环境、医药研究的各领域应用越
来越广泛，且随着现代化高新技术的不断发展及液相
色谱质谱联用技术自身的优点，液相色谱质谱联用技
术不断发展且发挥越来越重要的作用。
在原料药研发和生产中产品及中间体的液质联
用定性分析是关键环节，需要准确分析目标化合物的
纯度，用以监控反应和产品结构初步确认。随着液质
技术日新月异的发展，化工分析已不局限于单纯依靠
紫外保留时间判断产物和纯度，而是将多波长紫外检
测器与高分辨的质谱检测器结合使用，使得到的分析
结果更准确可信。对于较常见的杂环类化合物的液质
分析，难点主要在于随着化合物结构的改变，分析方
法需要作出灵活的调整。在分析过程中，对于结构新
颖的化合物，首先尝试经典的分析方法测试，之后根
据得到的紫外峰型和质谱信号判断分析方法是否合
适，调整分析方法中的一项或多项参数，在不断研究
探索中得到最适合该类化合物的分析方法。
本文就工作中使用高效液相色谱–质谱分析仪
器对部分原料药研发和化工生产中的测试方法开发
做出讨论，测试目标化合物主要为氮杂环类有机物，
分析的样品来自化学原料药研发实验室以及原料药
生产车间。
2.
液质谱联用技术基本术语
死时间
(dead time)：不保留组分的保留时间，即
流动相
(溶剂
)
通过色谱柱的时间。在反相 HPLC 中可
用苯磺酸钠来测定死时间
[3]。
保留时间
(retention time)：从进样开始到某个组分
在柱后出现浓度极大值的时间。
分离度
(resolution)：相邻两峰的保留时间之差与
平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离
程度。
拖尾因子
(tailing factor)：用以衡量色谱峰的对称
性。也称为不对称因子
(asymmetry factor)。
3.
仪器与试剂
1)
岛津高效液相色谱–质谱联用仪(LCMS-2020
EV)
2)
色谱柱：Sunfire C18 3.5 um 2.1 × 50 mm
；
Waters Atlantis T3 C1 8 3 um 4.6 × 100 mm
；
Waters Sunfire 3.5 um 3.0 × 150 mm
；
Waters X-bridge C18 3.5 um 3.0 × 50 mm
。
3) USP
纯化水
4)
乙腈(ACN)：色谱级，HPLC grade
甲醇
(MeOH)：色谱级，HPLC grade
甲酸
(FA)：色谱级，HPLC grade
5)
洗针液：甲醇和水
1:1 混匀
4.
实验部分
杂环化合物是分子中含有杂环结构的有机化合
物。构成环的原子除碳原子外，还至少含有一个杂原
子。杂原子包括氧、硫、氮等。从理论上讲，可以把
杂环化合物看成是苯的衍生物，即苯环中的一个或几
个
CH
被杂原子取代而生成的化合物。杂环化合物可
以与苯环并联成稠环杂环化合物。此类化合物在原料
药的研发和生产中有广泛应用。
杂环化合物的
LC-MS
分析检测主要使用反相液
相色谱–质谱联用，反相色谱是液相色谱中应用最广
泛的一种模式，通过物质疏水性的不同而实现分离，
属于一种液–液分配色谱
[4,5]。此类化合物分析的主要
问题和解决方法分述如下：
4.1.
大极性化合物的分析(样品 1)
R
R
2
N
N
N
R
1
O
N
3CF
3COOH
(
样品
1)
Cop
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高效液相色谱–质谱联用技术在杂环化合物分析中的应用
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4.1.1.
方法一
分析结果：
保留时间：
0.161 min
色谱柱：
Sunfire C18 3.5 um 2.1 × 50 mm (死时间
约为
0.5 min) 拖尾因子：1.334
流动相
B：乙腈/0.1%FA 采用方一分析时，样品出峰时间在死时间内，即
化合物没有很好的保留，并且色谱峰拖尾因子较大
(图
1)
。
流动相
A：水
/0.1%FA
流速：
0.9 ml/min 柱温：45℃
梯度洗脱表：
时间
(分钟
) %
流动相
A %
流动相
B
0.0 95 5
2.0 0 100
3.1 0 100
3.2 90 10
观察样品
的结构发现，样品的极性比较大，并且
是三氟乙酸盐的形式，于是更换液相色谱柱、流动相
和梯度洗脱的条件
(方法二
)，得到图2。
4.1.2.
方法二
色谱柱：
Waters Atlantis T3 C18 3 um 4.6 × 100
mm (
死时间约为
1.6 min)
流动相
B：MeOH
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.752.00 2.25 2.502.75 3.00
3.25 min
-0.25
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
mA U (x 1,000)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%
254nm,4nm (1.00)B.Conc.(Method)
0.161
Figure 1. Sample 1 underm UV spectra
图
1. 样品1 在方法一条件下于 254 nm波长的紫外谱图
the condition of the method 1 at a wavelength of 254 n
0.0
0.5 1.0
1.5 2.0
2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
mA U (x 1,000)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%
254nm,4nm (1.00)B.Conc.(Method)
1.819
2.034
3.241
3.385
Figure 2. Sa of 254 nm
图
2. 样品 1在方法二条件下于 254 nm波长的紫外谱图
mple 1 under the condition of the method 2 at a wavelength
高效液相色谱–质谱联用技术在杂环化合物分析中的应用
流动相
A
：Water/0.1%FA
5
℃
时间
(分钟
) %
流动相
A %
流动相
B
流速：
0.9 ml/min 柱温：4
梯度洗脱表：
0.0 98 2
10.0 40 60
15.0 40 60
质谱检测条件：
ESI 离子源，DL250℃，检测电
压
1.5 kV
：
无
拖尾因子：
.380
质谱信号：样
+ 1] = 456.05
从质谱图可以看出子量少
2的
且与样品极性相似的杂 此造成紫外峰
形对称性差
(
图
3)
，尝试更换长度为 150 mm的色谱柱
并调整洗脱梯度以提高分离度
(方法 4。
Waters Sunfire 3.5 um 3.0 × 150 mm
B
流动相
流速：
0.
梯度洗脱
%
流动相 A %流动相
B
分析结果：
.241 min
色谱柱和流动相
B
后，样品的
紫外出峰
乙腈
/0.1%FA 更换为甲醇
是由于
4.2.
含有与样品极性相似的杂质的分离(样品 2)
保留时间
：3
拖尾因子：
0.926
方法二改换了分析
位置在保留时间内，并且峰形对称，拖尾因
子明显减小，能够较真实的反映样品的纯度。
Waters
Atlantis T3
色谱柱采用优化的孔径、
C18 烷基键的键
合密度以及端基封尾技术，因此成为保留和分析极性
化合物的重要选择。
流动相
B由方法一中的
：虽然通常乙腈作为流动相有较好的峰型，但
甲醇的洗脱能力较弱，在样品保留性不好的情况下能
够起到提高保留效果的作用。色谱柱型号改变后，洗
脱梯度做出相应调整对于保留时间和峰型的优化也
有重要影响。
R
2
NH
O
N
N
N
R
3
R
1
(
样品
2)
方法三
℃
(
分钟
) %流动相 A %流动相
B
4.2.1.
色谱柱：
Sunfire C18 3.5um 2.1 × 50 mm
流动相 ：
BAcetonitrile/0.1%FA
流动相 ：
AWater/0.1%FA
流速： 柱温：
0.9 ml/min 45
梯度洗脱表：
时间
0.0 95 5
2.0 0
分析结果
分离度：
1
品
[M
杂质
[M + 1] = 454.05
，样品中包含着分
质没有分离，因
四
)
，得到图
4.2.2.
方法四
色谱柱：
流动相 ：
Acetonitrile/0.1%FA
：
AWater/0.1%FA
℃
5 ml/min 柱温：45
表：
时间
(分钟
)
0.0 50 50
12.0 30 70
15.0 30 70
100
3.1 0 100
3.2 90 10
质谱检测条件：
ESI 子源，DL250℃，检测电
1.5 kV
：
拖尾因子
质谱信号
[M + 1] = 456.25
HPLC
纯度：
91.2
板数，达到
提高分离 效果四通过改换 色谱柱和洗
脱梯度以及流动相洗脱流速，使极性非常相似的杂质
与样品的紫外峰完全分开，分离度和拖尾因子得到较
大改善，谱图能够真实反映样品的纯度，尤其在车间
样品和色谱柱的性质，改变色谱柱长度和相应调整洗
脱梯度对于分离度的改善有良好效果。
离
压
分析结果
分离度：
1.450
：
1.12
：样品
杂质
[M + 1] = 454.25
%(
面积百分比)
增加色谱柱长度相当于增加了理论塔
度的 。方法为长
生产监控中非常重要。因此在分析的过程中需要了解
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高效液相色谱–质谱联用技术在杂环化合物分析中的应用
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00
3.25 min
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
mAU(x1,000)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%
254nm,4nm (1.00)
B.Conc .(Method)
1.862
Figure 3. Sample 2 under the condition of the method 3 at a wavelength of 254 nm UV
图
3. 样品 2在方法三条件下于 254 nm波长的紫外谱图和质谱图
0.0
1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
6.0 7.0
8.09.0 10.0 11.0 12.0 min
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
mAU(x100)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%
2
B.Conc.(Meth od)54nm,4nm (1.00)
8.
921
8.666
Figure 4. Sample 2 under the condition of the method 4 at a wavelength of 254 nm UV
图
4. 样品 2在方法四条件下于 254 nm波长的紫外谱图和质谱图
Cop
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高效液相色谱–质谱联用技术在杂环化合物分析中的应用
5.
结果与讨论
本文主要针对高效液相色谱–质谱联用检测原
料药在研发和生产中的有机化合物过程中遇到的几
种问题展开讨论，在分析过程中需要针对不同化合物
的物理化学性质进行分析方法的改变和优化。
对于杂环类化合物，方法开发的重点在于保留时
间的保证和杂质的分离，通常采用选取合适的色谱柱
和洗脱梯度的方法实现
)
[1]
spectrometry general principles and instrumentation. Journal of
Chromatography A, 1991, 703(1-2): 37-57.
[2]
W. M. A. Niessen. Stae-of-the-art in liquid chromatography-mass
spectrometry. Journal of Chromatography A, 1999, 856(1-2):
179-197.
[3]
傅若农.
色谱分析概论[M].
北京
: 化学工业出版社, 2005.
[4]
J. G. Dorsey, W. T. Cooper. Retention mechanisms of bonded-
phase liquid chromatography. Analytical Chemistry, 1994, 66(17):
857A-967A.
[5]
A. M. Krstulovic, P. R. Brown. Reversed-phase liquid chroma-
tography. New York: Wiely, 1982.
http://www.cajcd.edu.cn/pub/wml.html
。
参考文献
(References
W. M. A. Niessen, A. P. Tinke. Liquid chromatography-mass
Cop
yright © 2013 Hanspub
147
|