本实验中使用的商品试剂均为分析纯，具体试剂详见 表1 ，本实验中的季铵盐型双子(gemini型)表面活性剂(12-s-12，s = 2、6和10)按照文献的方法在本实验室制备 [12] ，纯度 > 99.0%，所有合成12-s-12所用的试剂均为分析纯。

实验中需要的磷酸盐缓冲溶液(PBS)由二次去离子水(电导率1.2 × 10⁻⁶ S∙cm⁻¹)配制而成，采用双重纯水蒸馏器(SZ-93，上海亚荣生化仪器厂)蒸馏获得，称量NaHPO₄∙12H₂O和NaH₂PO₄∙2H₂O的质量分别为1.0335 g和0.3301 g定容于500 mL容量瓶中，得到10 mmol∙L⁻¹ (PH = 7.3)的缓冲溶液。实验中如没有特别说明缓冲溶液的浓度，均为10 mmol∙L⁻¹的PBS。

α-糜蛋白酶的活性是通过底物乙酸-2-萘酯在磷酸缓冲溶液中的水解速率进行评估测定的。通过使用TU-1900双光束紫外可见分光光度计得到在分解产物2-N在最大吸收波长(328 nm)下吸光度随时间的变化曲线，再将其转换为2-N的浓度随时间的变化曲线，由曲线初始线性部分的斜率来表征α-CT的活性，具体可见 图1 。

活性测量实验中，α-糜蛋白酶储备液避光保存30 min后使用，底物2-NA溶解于乙二醇中，同时采用超声震荡加速溶解30 min，由于加入的乙二醇的体积分数非常低，为3% (V_乙二醇/V_总)，并且已经有文献证明，具有与乙二醇相似结构的甘油不会改变缓冲溶液中α-CT的构象 [13] ，因此乙二醇的存在不会影响酶活性的测量。活性测量时温度恒定为25℃，测定温度由低温恒温槽控制。

实验前先打开恒温槽、紫外可见分光光度计和紫外分析软件各预热15 min，选择时间扫描光度模式，波长设定为328 nm，扫描方式选择单次扫描。实验开始前进行空气校零，然后分别向两个3 mL的比色皿中加入等体积的缓冲溶液、表面活性剂溶液和α-CT溶液，充分混合后放入比色皿槽内恒温避光保存10 min，避光放置后进行光度校零，然后向样品池中加入2-NA溶液，即可开始活性测量。

参比池除了不含有底物2-NA以外，其他实验条件均与样品池相同。实验得到的328 nm下2-N吸光度随时间的变化规律可以通过消光系数ε₃₂₈ = 1.53 × 10³ L∙M⁻¹∙cm⁻¹ [14] 处理得到2-N的浓度随时间的变化曲线。

活性实验中，α-糜蛋白酶水解底物2-NA生成产物2-N，在328 nm下测量2-N的吸光度随时间的变化，单次扫描10 min，得到2-N吸光度随时间的变化曲线。通过2-N在328 nm下的消光系数ε₃₂₈ = 1.53 × 10³ L∙M⁻¹∙cm⁻¹转化为浓度随时间的变化曲线，如 图1 所示，再由曲线的斜率得到α-CT的水解速率。在表面活性剂存在下α-CT的水解速率除以在缓冲溶液中的速率，即可得到相对活性。

图2 为0.10 g∙L⁻¹ α-CT在表面活性剂12-s-12 (s = 2、6和10)或DTAB中培养10 min后水解0.081 mmol∙L⁻¹ 2-NA的相对活性变化曲线。结果显示，12-s-12/α-CT或DTAB/α-CT体系在各自低浓度区(表面活性剂的临界胶束浓度以下)域均存在α-CT的超活性(v_r > 1)，在某一浓度下达到相对活性的最大值，之后随着表面活性剂浓度的增加，相对活性逐渐减小。从 图2 中可以得到12-s-12 (s = 2、6和10)和DTAB的最大相对活性，分别为v_r,max = 1.2、1.35、1.5和1.2，不难发现α-CT的相对活性与gemini表面活性剂的spacer长度正相关，即随着spacer长度的增加，相对活性逐渐增加，这一现象与已有文献关于spacer长度对酶活性和结构的影响表现出相似性 [3] [15] 。这个结果同样也吻合了表面活性剂阳离子头基的疏水性或尺寸大小可以调控α-CT活性的结论 [4] [16] [17] 。

另一方面，gemini型表面活性剂的电荷密度会随着spacer长度的增加而减小，当spacer足够长时，电荷密度会减小到一个比较小的值，类似于单链的阳离子表面活性剂的电荷密度。DTAB/α-CT体系在这里作为对比，因为DTAB的阳离子头基类似于gemini型表面活性剂头基的一部分，并且DTAB与α-CT的相互作用已经被很好的研究 [18] 。实验中DTAB/α-CT体系所得到的最大相对活性比12-s-12/α-CT体系低，说明单链的DTAB与含有共价连接基团的gemini型表面活性剂相比对α-CT具有不同的相互作用。

为了进一步探究具有不同spacer长度的表面活性剂12-s-12 (s = 2、6和10)其头基的电荷密度对α-CT活性的影响，我们尝试通过部分中和表面活性剂头基的电荷来改变头基的电荷密度，即引入无机盐反离子或带负电的表面活性剂。PH = 7.3的磷酸盐缓冲溶液，应用于所有的细胞质中，其中 ${\text{H}}_2{\text{PO}}_4^{-}$作为质子供体， ${\text{HPO}}_4^{2-}$作为质子受体：

${\text{H}}_2{\text{PO}}_4^{-}\rightleftarrows {\text{H}}^{+}+{\text{HPO}}_4^{2-}$ (1)

并与阳离子表面活性剂能达到同时平衡：

${\text{HPO}}_4^{2-}+\text{R}{\left({\text{CH}}_3\right)}_3{\text{N}}^{+}\rightleftharpoons {\left(\text{R}{\left({\text{CH}}_3\right)}_3{\text{N}}^{+}{\text{HPO}}_4^{2-}\right)}^{-}$ (2)

在这个体系中，我们直接忽略阳离子表面活性剂与 ${\text{H}}_2{\text{PO}}_4^{-}$的相互作用。公式(2)中描述的反应可以通过由缓冲溶液配制的表面活性剂溶液滴入相应浓度的缓冲溶液的电导率的变化来证实，如 图3 ，当增大缓冲溶液浓度时，磷酸根阴离子与阳离子表面活性剂之间的静电作用增强，导致表面活性剂的电导率值先减小后增加，同时也进一步说明增大缓冲溶液浓度是可以削弱表面活性剂头基的电荷密度的。

图4 为0.10 g∙L⁻¹ α-CT在表面活性剂存在下的相对活性随缓冲溶液浓度的变化曲线。对于12-s-12/α-CT体系，其最大相对活性所对应的缓冲溶液浓度与12-s-12的spacer长度有关，即10 mmol∙L⁻¹，50 mmol∙L⁻¹ 和60 mmol∙L⁻¹分别对应于12-10-12，12-6-12和12-2-12，这一规律与表面活性剂头基电荷密度的增加顺序一致。作为对比的DTAB/α-CT体系，在缓冲溶液浓度达到40 mmol∙L⁻¹时出现α-CT的最大相对活性。

从这个结果，我们可以认为12-s-12头基电荷密度的削弱在一定程度上有利于激活α-CT，具有较短间隔链长度的表面活性剂，或者说，具有较大电荷密度的表面活性剂在较高浓度缓冲溶液的调控下更有利于得到较高的相对活性。具有不同spacer长度的表面活性剂对α-CT活性具有不同的影响也可以从头基的尺寸以及疏水性来解释 [4] [16] ，即表面活性剂头基的尺寸越大，头基的电荷密度相对越低，导致表面活性剂与α-CT之间的静电作用越弱。

另一方面，对于表面活性剂头基的疏水作用似乎是不确定的，因为我们还不能证明疏水的亚甲基间隔链是否插入了酶的疏水区域。如果我们假设连接两个头基的spacer与α-CT负电荷周围的疏水残基间的疏水作用是明显的，那么这就会缩短带正电的表面活性剂与带负电的α-CT之间的距离，从而增强它们之间的静电作用，但这将与之前讨论的电荷密度影响或头基的尺寸效应等结论相互矛盾。

为了进一步确认α-CT相对活性随着缓冲溶液浓度的变化主要来源于表面活性剂电荷密度的改变而不是简单地PBS影响，我们做了0.10 g∙L⁻¹ α-CT在纯磷酸盐缓冲溶液中的活性(见 图4 ，虚线以下)。α-CT在10~70 mmol∙L⁻¹的缓冲溶液中的相对活性总体变化不大，其中相对活性最低达到90%，说明高浓度的磷酸缓冲溶液本身对α-CT的活性仅有微弱的影响。