本实验所需的材料与仪器(如 表1 所示)。

用斑马鱼的养殖水为溶剂，在1.5 mL的EP管中加先加入1 mg的五水硫酸铜粉末再加入1 mL养殖水，充分震荡摇匀作为原始溶液，根据所需的浓度再稀释成不同浓度的实验组浓度。

1) 毒性安全性设置空白组，0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL，每组分别需要30条幼鱼，每组分别设置三组平行实验，以上方案重复三次，在恒温恒湿的环境中从幼鱼孵育第3天给药至第7天。立即换药至96 h，每次换药后记录斑马鱼幼鱼的存活数。

2) 全身毒性设置空白组，0.1 μg/ml、0.4 μg/ml，每组30条鱼，每组分别设置三组平行实验，以上方案重复三次，从幼鱼孵育第3天给药至第6天，即换药至72 h拍照记录结果。

3) 硫酸铜对斑马鱼幼鱼运动能力的实验方法为，在安全毒性范围内，加药后观察幼鱼的运动状态和应激反应；加药后，每隔24 h在体式显微镜下观察幼鱼的生理形态是否改变。

存活率 = 存活数/总数 × 100% (公式1)

在同一时间内使用不同浓度硫酸铜的情况下，观察斑马鱼的存活数量，如 表2 所示。每个实验组有三个平行实验组，每一组有三十条斑马鱼。空白组，24~96 h斑马鱼的存活数为30条；0.5 μg/mL，24 h斑马鱼存活数为30条，48 h斑马鱼的存活数为26条，72 h斑马鱼的存活数为23条，96 h斑马鱼存活数为18条；1 μg/mL，24 h斑马鱼存活数为30条，48 h斑马鱼存活数为24条，72 h存活数为18条，96 h斑马鱼存活数为11条；2 μg/mL，24 h斑马鱼存活数为30条，48 h斑马鱼存活数为21条，72 h斑马鱼存活数为17条，96 h斑马鱼存活数为5条；4 μg/mL，24 h斑马鱼存活数为25条，48 h斑马鱼存活数为16条，72 h斑马鱼存活数为9条，96 h斑马鱼存活数为0条。

由 图1 可知，空白组的斑马鱼幼鱼从24 h到96 h的存活率均为100%；0.5 μg/mL的组，24 h的斑马鱼幼鱼存活率为100%，48 h存活率为90%，72 h存活率为75%，96 h存活率为61%；1 μg/mL的组，24 h的斑马鱼幼鱼的存活率为100%，48 h至96 h斑马鱼幼鱼的存活率逐渐下降，96 h斑马鱼幼鱼的存活率为37%；2 μg/mL的组，24 h的存活率为100%，48 h至96 h斑马鱼幼鱼的存活率逐渐下降，96 h斑马鱼幼鱼的存活率为16%；4 μg/mL的组，24 h斑马鱼幼鱼的存活率为100%，48 h至96 h斑马鱼幼鱼的存活率为0%。由图一可知，48 h至96 h，四组实验组中斑马鱼幼鱼的存活率随着时间的延长均降低，与前三组相比4 μg/mL组的硫酸铜的毒性较强一些。在预实验的过程中，经过三次相同的条件实验后发现，0.4 μg/mL是硫酸铜对斑马鱼的安全毒性范围的上限。在安全的毒性范围之内进行下一步的炎症损伤的探索。

观察在同一浓度下，随着时间的延长斑马鱼损伤部位中性粒细胞的分布(如 图2 )，空白组24 h至72 h荧光标记的中性粒细胞集中分部在斑马鱼的血液循环系统中，因为空白组的斑马鱼幼鱼没有暴露在硫酸铜溶液中，硫酸铜没有对斑马鱼幼鱼造成毒性损伤。与空白组相比较0.1 μg/mL和0.4 μg/mL的组中24h至72 h的中性粒细胞遍布在斑马鱼幼鱼的全身，随着暴露在硫酸铜溶液中的时间不断增加，从而导致全身性损伤不断增多，所以72 h体式显微镜下观察到斑马鱼幼鱼体内荧光相较于24 h更明显。0.4 μg/mL的组比0.1 μg/mL的组中性粒细胞的分布更加明显，因为硫酸铜的浓度越高对斑马鱼的炎症损伤越重。因为中性粒细胞是免疫细胞的一种，当机体出现损伤时，中性粒细胞会聚集在受伤的部位，机体损伤越重，中性粒细胞聚集的越多。

在不同浓度的情况下，观察斑马鱼运动的能力(如 表3 )，在实验过程中发现，与空白组相比较，0.4 μg/mL的浓度中的斑马鱼的反应能力最差、运动最迟缓并且斑马鱼背脊扭曲的含量占10%。0.1 μg/mL的组中，斑马鱼的运动能力与空白组相比较，受到了抑制；与0.4 μg/mL相比，较活跃。

本实验选择斑马鱼为模型。因为目前已经被认可的模型动物有鼠、兔、狗等哺乳动物，同时斑马鱼作为一种水生生物是当前新兴起的一种模型，人们发现一些炎症模型在哺乳动物身上研究耗时耗力，但在斑马鱼凭借着便宜易操作等优点被用作多种炎症模型。目前的实验中，斑马鱼的炎症模拟主要采用以下三种方式，分别是经过断尾诱导的局部炎症、使用脂多糖诱导的全身炎症和硫酸铜诱导的急性炎症 [20] 。据研究指出，芬尼太炎症模型可被视为一种对斑马鱼产生神经毒性的炎症模型，导致其心脏和神经受到损伤，这种影响需要进一步探讨，尤其对孕妇避免潜在毒性具有一定的借鉴意义 [21] 。斑马鱼断尾炎症模型是一种创伤性炎症模型，进行斑马鱼尾部断尾处理可引发尾部局部损伤，激活斑马鱼免疫细胞的免疫应答。在斑马鱼发育的早期阶段，伤口处的巨噬细胞和中性粒细胞数量在斑马鱼断尾后的6 h达到巅峰，而随后6小时内炎症反应开始逐渐减弱 [22] 。因此，评价药物处理是否可以逆转由脂多糖诱导的免疫细胞增多，成为衡量其抗炎活性的重要指标之一 [23] 。斑马鱼硫酸铜炎症模型是一种急性炎症模型，通常由硫酸铜诱导。铜在斑马鱼的先天免疫系统中扮演着重要的作用，通常诱导氧化应激等途径积极调节炎症反应。在斑马鱼的幼鱼和成鱼中，硫酸铜刺激导致斑马鱼免疫细胞快速移动到神经丘，从而促使炎症特征的诱导和模拟 [24] 。相较于物理损伤和感染剂方法，铜作为致炎剂在操作时采用的是无创方法。通过免疫细胞向神经丘的迁移来实现细胞的回流，进而评估药物的抗炎活性 [25] 。

在2013年，经济合作与发展组织发布了测试指南，针对斑马鱼胚胎进行急性毒性测试。斑马鱼胚胎急性毒性测试采用了一种新的方法，即在24孔板中暴露特定细胞期的胚胎于受试物 [26] ，然后观察胚胎在受精后48小时和96小时的死亡情况，并计算半数死亡浓度，以评估测试物的急性毒性。通过与基于成鱼的鱼类急性毒性试验相比，该方法有效地简化了实验的流程，并提高了实验效率，被建议作为传统的鱼类急性毒性试验的有效替代。目前一般认为，斑马鱼胚胎和成鱼在毒性试验中表现可能不同，可能是因为毒物在实验材料中的动力学过程存在差异，导致胚胎摄取和代谢毒物的能力可能较弱，从而对毒性损害可能不敏感。有一种看法认为，斑马鱼胚胎对神经毒素的抵抗力较强，这可能与其呼吸功能的不完善有关，而成鱼的呼吸系统对神经毒素很敏感，可能导致缺氧甚至死亡。以目前的情况来看，基于孔板的斑马鱼胚胎急性毒性试验可能并非理想的替代方法。鉴于此，有研究人员开始关注可以在孵化器中培养的幼鱼，这些幼鱼能提供更好的毒性试验替代方案。研究表明在3至8天斑马鱼幼鱼进行药物的48小时和96小时急性毒性试验，并将结果与胚胎和成鱼数据进行对比，结果显示幼鱼对急性毒性的敏感性更接近成鱼。本实验所用的方法也是孔板毒性测试，选用中性粒细胞标记的斑马鱼幼鱼，置于24孔板中 [27] 。

斑马鱼是近些年新兴的实验动物模型，其与哺乳动物具有相似的基因组及经济等优势被人们选中，在研究人类疾病和研究新药做出巨大贡献。在由于斑马鱼与人类的遗传信息相似，同时神经系统也有相似之处。据研究显示，斑马鱼和人类都含有丰富的多巴胺、胆碱等激素，其脑组织同样进行了功能区域的划分，表现出学习、睡眠等行为 [28] 。最近研究心血管疾病更加细致深入，其中敲除斑马鱼的载脂蛋白E基因，这对研究动脉粥样硬化的模型很有帮助。一项研究指出，载脂蛋白E基因与极低密度脂蛋白和胆固醇等的代谢息息相关，而斑马鱼的载脂蛋白E基因的氨基酸序列与人类的相似，这为高脂血症模型的建立和降脂药物的研发提供了可能。在斑马鱼体内，尿酸的含量在第五天达到了最高的水平，五天后，尿酸酶开始作用，促使尿酸快速代谢。科学研究揭示，摄入过多的黄嘌呤钠盐，会导致尿酸的合成增加。斑马鱼高尿酸的模型中显示，苯并咪唑林可能干扰黄嘌呤代谢，从而降低尿酸的生成。目前，斑马鱼已广泛运用于药理学、发育学和环境毒理学等领域的研究，得益于其成本低廉、高效率等优势，颇受学者欢迎。斑马鱼的不同发育阶段涵盖了多样的评价指标，展现出其发育过程的复杂性。随着科学技术的不断进步，转基因技术在斑马鱼实验中的应用变得更加广泛。金属离子对斑马鱼造成的全身毒性实验显示，转基因荧光斑马鱼因毒素作用而发生变化，特别是通过这种方式监测水中重金属、环境毒性和综合毒性等方面，取得了显著的成果，引起了广泛的应用。斑马鱼模型在研究老年人骨质疏松的方向也有重大的成果，随着年龄的增长，生命体的各项功能会严重退化。对于脊柱动物而言，骨是机体构成的重要框架，人体会因为缺钙、缺乏维生素D导致骨折，但是骨细胞的变性及失活也是影响骨健康什么重要的一点。斑马鱼模型在短期内可以得到大量的实验用鱼，研究缓解骨质疏松的药物以及探索免疫因子作用的机制已经被人们广泛关注。

斑马鱼的活动受多个系统的共同作用，包括中枢神经和免疫系统 [28] 。当斑马鱼接触有毒物质时，会引发相应的生理变化，进而影响其内部不同的功能系统，如消化系统和免疫系统，从而影响其运动能力。研究指出黑质在斑马鱼的运动中扮演关键的角色，同时黑质细胞的退化和多巴胺不足也是帕金森病的主要诱因。斑马鱼受到中枢系统的调节，与此同时氧化应激也对其运动能力产生重要影响。氧化应激反应是机体内活性氧的含量失衡导致的。据研究显示，当斑马鱼体内的活性氧超过正常水平时，会触发氧化应激反应，这种反应可能破坏DNA并导致蛋白表达的异常，从而影响斑马鱼的运动能力。研究表明 [29] ，当斑马鱼持续暴露在铜离子中运动能力会下降，并且导致体内出现氧化应激现象，进一步导致斑马鱼的运动感知能力的损伤。在斑马鱼体内积聚的金属铜，会对其运动神经系统产生不利的影响，使其运动能力受损。硫酸铜不仅影响鱼类的生长发育，还影响水环境中贝类、虾类的生长发育，抑制蓝藻的生长，调节某些菌类的平衡。当硫酸铜过量时，会抑制水生生物的呼吸、导致水体中氧气与二氧化碳的失衡。

如 图1 所示，本实验在24 h至96 h斑马鱼分别在暴露在0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL硫酸铜溶液后会呈现出威胁生命的毒性反应，且在相同的时间随着硫酸铜浓度越高对斑马鱼的生命危害越严重。有学者研究表明斑马鱼暴露于多种污染物，在相同的时间，随着污染物浓度的增加，斑马鱼的死亡率随之增加 [30] 。本实验中硫酸铜对斑马鱼的安全性毒性范围为0.1 μg/mL至0.4 μg/mL，在这两个浓度下72 h观察到，硫酸铜对斑马鱼造成明显的全身性炎症损伤。如 图2 所示，在荧光显微镜下观察到相同的时间，硫酸铜的浓度越高，对斑马鱼的损伤越明显；相同的浓度，随着暴露时间的增加，对斑马鱼的损伤越明显。同时如 图2 所示，本实验中暴露在0.4 μg/mL的硫酸铜中的斑马鱼会出现脊背弯曲的情况。有学者研究表明暴露在多种金属污染物中，相同的浓度时对斑马鱼的损伤程度会有差异，随着污染物浓度的增加，对斑马鱼的损伤会加重，同时相同条件下斑马鱼的各个机能部位对于不同金属污染物的敏感程度也会有差异 [31] 。

科技的不断进步推动了人们的生产和生活方式，也导致了许多对环境造成污染的物质的产生。城市和工业排放的废水中含有许多复杂的金属成分，种类和含量变化繁多。实验结果显示，将斑马鱼幼鱼暴露在污水处理厂的污水中短暂的时间后，他们的生理形态发生明显的改变，包括运动能力和脊柱形态都会出现异常。斑马鱼作为一种新兴的模型动物，有着广阔的发展空间且可以创造经济效益。斑马鱼模型已经出现在我国的太空实验站，斑马鱼被我国选中作为进入太空实验室的动物之一，有着其独特的优势，在太空实验室中已经观察到了，当斑马鱼的心脏物理性受损，经过一段时间后，竟然奇迹般的愈合并进行正常的心脏功能。现如今，斑马鱼已经成为深入研究斑马鱼模型的器官发育和细胞生长等试验为了人类更好适应太空环境。此外国内已经进行了大量关于金属污染物对斑马鱼的影响的研究，但对斑马鱼体内毒素作用机理的认识仍需深入。