肝癌为常见恶性肿瘤之一，在我国，原发性肝癌是第4大常见恶性肿瘤及第2大肿瘤致死病因，仅次于肺癌。HCC占所有肝癌的75%至85% [1] 。HCC是一种由多种风险因素引起的多因素疾病。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)或丙型肝炎病毒、黄曲霉毒素污染的食物、大量饮酒、肥胖、吸烟和2型糖尿病是HCC的主要危险因素 [2] [3] 。HCC的发生是病毒特异性因素、免疫机制、环境因素和遗传学共同作用的结果，肝癌发病隐匿，早期诊断很困难 [4] 。大多数患者发现时为晚期HCC，预后情况差，5年生存率仅为14.4% [5] 。

临床症状、影像学诊断和分子生物标志物是HCC检测最常用的诊断依据 [6] 。尽管影像方面腹部超声一直是HCC筛查的首选方法，但其检测早期肝细胞癌的灵敏度明显较低，仅为47% [7] 。因此，HCC生物标志物已经成为肝癌早期诊断研究领域的焦点，这些生物标志物可以提高早期HCC检测的敏感性。但HCC异质性显著限制了HCC患者的诊断和治疗 [8] - [10] ，单一生物标志物在HCC诊断上仍存在局限性。随着高通量测序的出现和精准医学的发展，基于个体异质性的组织学诊断使个体化诊断和靶向HCC治疗成为可能 [11] [12] 。多组学包括循环肿瘤细胞、基因组、转录组、蛋白质组等，联合诊断应用，确定了生物学异质性，并为HCC诊断提供了新的见解。

本文我们从多组学数据方面综合分析了各种HCC生物标志物在诊断方面的潜在价值和应用前景。

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells, CTC)常被认为从原位癌内渗到外周血或淋巴系统的一类肿瘤细胞，是远处转移和复发的主要细胞来源之一 [13] [14] 。涉及多种机制，包括上皮–间充质转化(Epithelial-me-mesenchymal transition, EMT)和非EMT介导的易位 [14] 。这个过程发生在肿瘤发展的每个阶段。因此，CTC作为液体活检技术是HCC诊断和动态检测的有用工具 [15] 。

CTC可以使用基于其物理和生物特性的方法进行分离和富集。物理特性包括大小、密度、迁移能力和电荷，并且可以防止不表达特定标记物的CTC逃逸。然而，CTC的分离和富集对癌症的特异性较低 [15] 。各种生物特性技术依赖于与CTC表面标志物结合的特异性抗体，包括但不限于上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecules, EpCAM)、人表皮生长因子受体、细胞角蛋白(Cytokeratin, CK)家族成员(CK8、CK18和CK19)和间充质标志物。在这些标志物中，CD90和EpCAM用于检测具有肿瘤干细胞活性的CTC [16] 。从基因组、转录组学、蛋白质组学和代谢组学水平获得的大量分子数据有助于开发基于CTC的特异性生物标志物组合，从而有助于疾病监测 [17] 。

已经进行了大量研究验证CTC的诊断价值。Cui等 [18] 对20项研究(共1191名患者)进行的荟萃分析表明，基于CTC的HCC诊断具有95%的敏感性和60%的特异性，尽管CTC的敏感性高，但其特异性低。Guo等 [19] 发现，与健康对照组相比，使用基于优化的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应平台在HCC患者中可检测到的CTC上皮细胞粘附分子信使核糖核酸(Epithelial cell adhesion molecule Messenger RNA, EpCAM mRNA)阳性率明显更高(P < 0.05)，而CTC (EpCAM mRNA+)结合AFP水平用作区分HCC与对照组的曲线下面积(Area Under Curve, AUC)为0.857，灵敏度为73.0%，特异性为93.4%，利用CTC联合AFP能准确检测早期HCC和AFP阴性的HCC。此外CTC在诊断HBV相关HCC具有重要的临床意义，Guo等 [20] 使用优化的实时荧光定量聚合酶链反应的检测平台，对CTC与肿瘤干细胞表型进行了分层分析，发现联合使用四种肿瘤干细胞的生物标志物(EpCAM、CD90、CD133和CK19)检测在诊断HCC方面优于单独使用EpCAM，并且在训练集和验证集中的AUC分别为0.88和0.93。CTC不仅可以进行早期检测，还可以深入了解肿瘤转移和复发，在预后中发挥重要作用 [21] - [23] 。Qi等 [22] 证明CTC和间充质CTC的百分比与早期复发、多发性肝内复发和肺转移显著相关。Kelley等 [24] 人发现，CTC ≥ 1/7.5个/mL的患者更可能出现AFP ≥ 400 ng/mL (P = 0.008)和血管浸润，与患者生存率降低相关。

尽管CTC在HCC诊断中显示出较高的敏感性，但其特异性仍然较低。未来研究应着重提高CTC检测的特异性，并探讨CTC与其他生物标志物(如循环肿瘤DNA和基因突变)的组合使用，以提高诊断准确性 [25] [26] 。研究表明，通过优化CTC富集和鉴定方法，可以在一定程度上提高特异性 [25] 。此外，将CTC与其他液体活检标志物结合使用，如循环肿瘤DNA和基因突变分析，有望进一步提高诊断的准确性 [26] 。未来的研究方向应集中在开发更精确的CTC分离技术，以及探索多种生物标志物的联合检测策略。

循环肿瘤(Circulating tumor DNA, ctDNA)是血浆或血清中的细胞外DNA，源自肿瘤细胞的代谢分泌、凋亡或坏死。ctDNA携带肿瘤特异性的遗传和表观遗传变异，如DNA甲基化、突变和拷贝数变化。ctDNA的微创特性使得通过少量外周血样本即可进行肿瘤基因组监测，为癌症遗传分析提供了一种便捷而准确的途径 [27] 。ctDNA是肿瘤诊断和预后评估的重要生物标志物 [27] ，尤其在HCC中，它不仅是复发、转移和总生存期的独立预后因素，还能提供肿瘤侵袭性的信息 [28] 。Chan等 [29] 对39例原发性肝细胞肿瘤患者进行了研究，对比了单独依赖循环游离DNA (Circulating cell-free DNA, cfDNA)浓度作为肝癌检测指标的敏感性为56.4%，而利用cfDNA浓度联合甲胎蛋白作为依据的检测敏感性可达71.8%。

在基因表观遗传组学方面，ctDNA中的甲基化模式可用于HCC的诊断 [30] 。HCC中甲基化改变可能导致抑癌基因(Tumor suppressor genes, TSG)的抑制或癌基因的促进，从而导致肝癌的发生和发展 [31] 。研究表明，HCC患者肿瘤组织中DNA甲基化发生变化，包括谷胱甘肽S-转移酶P1 (Glutathione S-transferase P1, GSTP1)启动子区的异常甲基化和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p15和p16 [32] [33] 。已观察到HCC患者ctDNA中的高甲基化位点：GSTP1、p15和p16等 [34] - [36] 。Wang等人 [34] 进行的研究显示，GSTP1启动子CpG位点在26个肿瘤组织中的23个(88.5%)和26个相应非肿瘤组织中的18个(69%)中具有高甲基化。Huang等 [30] 分析了血浆中腺瘤样结肠息肉易感基因、GSTP1基因的甲基化状态，基因的联合诊断将AUC增加到0.933，区分HCC患者与正常健康对照者的敏感性为92.7%，特异性为81.9%，证明了ctDNA对肝细胞癌具有足够的诊断价值。Ahn等人 [37] 在另一项研究得出免疫缺陷伴血小板减少综合征蛋白家族成员2 (Wiskott-Aldrich Syndrome Protein Family, Member 2, WASF2)甲基化状态与mRNA表达呈负相关，位于WASF2启动子中的CpG位点高甲基化在HCC中过表达，在临床上与不良预后相关。甲基化特异性聚合酶链反应已广泛用于甲基化研究，提供了一种快速简便、高灵敏度和准确性的方法。ctDNA中甲基化模式的组织特异性可能有助于确定原始肿瘤位置。上述结果表明，综合评估ctDNA中的甲基化模式，可能是诊断HCC的有力工具。

ctDNA甲基化分析在HCC诊断中展现出巨大潜力，但仍存在一些关键问题需要解决。首先，甲基化位点的选择对诊断准确性至关重要，需要建立严格的筛选标准 [38] 。其次，不同的检测方法各有优缺点，如亚硫酸氢盐测序和甲基化特异性PCR，需要根据具体情况选择最适合的技术 [39] 。最后，整合多个甲基化标志物和其他生物标志物(如甲胎蛋白和突变基因)的联合检测策略，有望显著提高HCC诊断的敏感性和特异性 [40] 。

在HCC中，TP53细胞周期是基因突变(定义为突变频率 > 5%)主要关联的信号通路。现有的HCC基因组图谱主要基于肿瘤的静态体细胞突变，尚未充分解释肿瘤内突变如何影响肿瘤免疫微环境。

TP53基因作为一个高度突变的抑癌基因，涉及人类多数肿瘤。该基因位于染色体17p13.1，由12个外显子和10个内含子组成，其蛋白产物P53维持着细胞正常的基本活动，如细胞周期、细胞衰老、细胞凋亡和DNA损伤修复 [41] [42] 。TP53基因突变作为HCC里最常见的突变，与黄曲霉毒素B1和HBV感染有关 [43] 。TP53不仅与肿瘤增殖、迁移、生长、侵袭及化疗药物的耐药性相关 [44] [45] ，同时具有TP53基因突变的患者肝癌复发时间和总生存期也会受到影响 [46] 。单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism, SNP)作为基因重要的变异形式，影响肝细胞癌患者术后预后 [47] 。此外，有研究对DNA高甲基化区域进行了聚类分析和基因功能富集分析，发现TP53的靶基因在DNA高甲基化片段中显著富集 [48] 。TP53作为体内重要的转录因子，参与调节细胞生长、维持基因组稳定性和抑制肿瘤血管生成 [49] ，野生型TP53作为抑癌基因，可抑制肿瘤的发生 [50] 。TP53的丝氨酸249 (Serine at position 249, Ser249)是HCC患者中最常报道的突变位点，导致特异性DNA结合能力丧失 [51] ，TP53的Ser249突变与中国人患有肝硬化和HCC密切相关 [52] 。

TP53基因突变在HCC发生发展中扮演着重要角色，其在液体活检中的检测为非侵入性诊断提供了新的途径。研究表明，TP53突变与CTC和ctDNA水平存在一定的相关性，可能反映肿瘤的异质性和进展程度 [53] 。然而，TP53突变检测仍面临着敏感性和特异性的挑战，需要进一步优化检测方法。未来的研究应着重探索TP53突变与其他生物标志物的组合使用策略，以提高诊断准确性 [54] 。

转录组学研究表明，循环微小RNA在HCC中呈现特异性异常表达 [55] - [57] ，结合常规的AFP和超声筛查，在高危人群中筛查HCC具有很好的应用前景 [4] [58] 。目前，血清中的RNA，包括mRNA、环状RNA、微小RNA和长链非编码RNA，已成为HCC诊断生物标志物研究的热点。下文将重点阐述微小RNA和长链非编码RNA。

蛋白质组学中多种生物标志物已被发现对HCC的早期诊断具有重要价值，这些标志物包括AFP、甲胎蛋白异质体L3 (Alpha fetoprotein isoform L3, AFP-L3)、异常凝血酶原(Des-gamma-carboxyprothrombin, DCP)、高尔基体跨膜糖蛋白73 (Golgi protein 73, GP73)等 [70] [71] 。虽然这些蛋白质组学分子可以作为HCC的诊断标志物，但它们单一诊断HCC的敏感性和特异性存在差异 [72] [73] 。

结合临床变量(如年龄和性别)和联合应用生物标志物(如AFP、AFP-L3、DCP和GP73)能显著提高HCC的早期诊断准确性 [74] [75] 。GALAD评分系统，结合了临床因素和生物标志物，能提高区分HCC和肝硬化的性能 [76] 。特别是，DCP在AFP阴性的HCC患者中具有较好的诊断价值，而GP73作为一种新型血清肿瘤标记物，在HCC中的表达水平显著升高，与肿瘤的进展和转移密切相关，单一生物标志物可能不足以提供最佳的敏感性和特异性，尤其是对于检测早期HCC，但联合多个生物标志物可以提高HCC早期诊断率 [77] 。这些发现强调了多个标志物联合检测在提高HCC早期诊断中的重要性。

肝细胞癌的发生发展机制复杂，早期症状隐匿，缺乏有效的早期筛查技术，导致部分HCC患者在确诊时已处于中晚期。比如：影像学诊断HCC在非肝硬化、小结节(<1 cm)或非典型特征患者中诊断有局限性，需进一步行肝活检。但肝活检在小病变中穿刺难度较大，且假阴性率为3%~11% [78] 。由于早期诊断率相对较低，这直接影响了患者的5年生存率，通常仅为14.4% [5] 。

本文根据多项研究结果总结后发现，单一生物标志物在HCC诊断中存在局限性，缺少足够的前瞻性多中心研究的支持。通过整合基因组学、表观遗传学、转录组学、蛋白质组学等多组学生物标志物数据，构建更精确的诊断模型，可以提高HCC诊断的准确性。如：HCC异质性强，AFP检测可结合蛋白质组学、基因组学等多组学方法，提高检出率，比传统活检更快速、经济，有助于肿瘤分析 [79] 。但仍存在一些局限性，如：液体活检技术检测灵敏度和特异性仍需进一步提高，特别是对于早期HCC的诊断 [80] 。其次，不同实验室和平台之间的检测结果缺乏标准化，影响了结果的可比性和临床应用。液体活检在临床实践中的推广还面临着成本、技术复杂性和医疗保险覆盖等问题 [81] 。解决这些挑战将是未来研究的重要方向，以充分发挥液体活检在HCC诊断中的潜力。

相信高通量测序技术的发展将推动多组学生物标志物在HCC早期诊断中的应用，提高诊断准确性并改善患者预后。未来联合多组学标志物研究可聚焦于标志物的表达、诊断临界值、检测技术优化以及多组学间的关联性，以发现新的肿瘤标志物或早期诊断技术，为促进HCC早期诊断和改善预后提供希望。

^*通讯作者。