由于银耳相关生物活性成分在常规数据库中收录很有限，本研究同时纳入木耳(包括黑木耳、皱木耳等)的活性成分以扩大筛选基数。在中国知网、万方数据、维普、PubMed和本草组鉴数据库(HERB¹)检索木耳、银耳、黑木耳、皱木耳的化学成分，共获取42个化学成分。对于HERB数据库收录的化学成分以Lipinski的五规则即分子量(MW < 500)、脂水分配系数(AlogP < 5)、氢键供体数(Hdon < 5)、氢键受体数(Hacc < 10)和旋转键(RBN < 10)为条件筛选 [14] 。同时将在HERB数据库找不到相关信息的化学成分在中药系统药理学分析平台(TCMSP²)进行检索，以口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 10%及类药性(drug-likeness, DL) ≥ 0.10为条件筛选活性成分。然后登录Pubchem³数据库获取通过筛选成分的SMILE编号和2D结构 [15] ，并在Swiss Target Prediction⁴数据库限定物种为“homo sapiens”后输入编号获取银耳、木耳活性成分的作用靶点。

以“constipation”为关键词，通过Genecard⁵、TTD⁶、OMIM⁷、CTD⁸数据库检索获得便秘疾病相关靶点，在Genecards、CTD数据库的检索结果分别利用“Relevance Score”值≥中位数和“Inference Score”值≥中位数将所获取的疾病基因进行筛选 [16] 。将4个数据库筛选过后的数据进行合并去重，得到便秘相关的靶点。

登录微生信可视化云平台⁹，在Venny2.1软件界面分别输入银耳作用靶点和便秘的疾病相关靶点，获取二者共有的作用靶点。

将银耳、木耳的活性成分以及“2.3”所获取的潜在作用靶点分别导人Cytoscape 3.10.3软件，构建“成分–疾病–靶点”相互作用网络，使用Cytoscape插件Network analysis对网络特征进行分析。

将“2.3”获得的相交靶点输入到STRING¹⁰数据库中，设置物种为“Homo sapiens”，设置置信度为≥0.4，建立靶点蛋白之间的相互作用网络并进行分析，获得靶点之间的相互关系，隐藏无相互作用的靶点，获得蛋白相互作用结果图和STV格式文件。然后将STV文件导入Cytoscape3.10.3软件对其进行可视化分析，使用CytoHCA、CytoHubba和MCODE三种方法来确定重要蛋白。CytoHCAc插件以网络拓扑学参数如度值(Degree)、中介中心性(Betweenness centrality, BC)、紧密中心性(closeness centrality, CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality, EC)、局部平均连通性(local average connectivity, LAC)和网络中心性(network centrality, NC)的中位数筛选银耳、木耳作用于便秘的关键靶点。CytoHubba插件以度值(Degree)、边缘渗透组件(EPC)和最大团中心性(MCC)为分析参数进行拓扑分析。根据MCC由高到低排序，筛选出10个核心基因，在此基础上，通过MCODE插件来确定PPI网络中连接密度最大的区域，此区域作为一个模块，并给予打分，该分数反映此模块与周围节点的密度，得分越高，说明该模块中节点的重要程度越高。获取蛋白相互作用信息，将其导人Cytoscape3.10.3软件，绘制PPI网络，并根据节点的度值筛选出核心靶点。

将“药物–活性成分–靶点”图中排名前5的活性成分与PPI网络中筛选到的靶蛋白进行分子对接。从PubChem的数据库中下载SDF格式的小分子药物，从RCSB PDB数据库¹¹下载蛋白质，用OpenBabel 3.1.1软件将SDF格式文件转化为PDB格式文件。利用Auto Dock Tools-1.5.6软件对蛋白进行去水、加氢原子、能量最小化、确定扭转键等处理，然后使用Autodock进行活性位点对接，并使用Actodock Vina算法计算结合能，最后利用PyMOL软件进行可视化分析 [17] ，然后采用Discovery Studio 2019 软件绘制蛋白质–小分子2D互作模式图。

通过文献与数据库检索共获得42个化学成分 [2] [18] - [22] 。首先将HERB数据库收录的9个活性成分以Lipinski的五规则为条件筛选后剩余6个，将HERB数据库未收录的32个活性成分通过TCMSP数据库收集并以口服生物利用度(OB) ≥ 10%及化合物类药性(DL) ≥ 0.10为条件筛选得到26个活性成分。然后根据活性成分的SMILE编号在Swiss Target Prediction数据库选择物种为“homo sapiens”获取相关靶点，其中有3个活性成分未能找到相应靶点，其余23个活性成分(见 表1 和 表2 )，以“Probability > 0”为标准条件筛选后有1990个作用靶点。整合后去除787个重复靶点，得到402个活性成分靶点。

通过在CTD、OMIM、TTD和GeneCards这四个数据库中检索“Constipation”相关靶点，其中GeneCards数据库共检索到8669个靶点，剔除后得到4452个靶点，而CTD数据库共检索到20,214个靶点，剔除后得到5061个靶点。TTD数据库共检索到11个相关靶点。OMIM数据库共检索到369个相关靶点，剔除遗传靶点以及重复靶点后，剩余48个。将四个数据库检索得到的靶点合并，共得到9598个。进一步剔除3133个重复靶点后，最终确定7804个靶点。采用Venny 2.1工具将获取的成分靶点与银耳靶点进行交集并绘制韦恩图。最终发现305个交集靶点(见 图1 )。

使用Cytoscape 3.10.3对305个交集靶点绘制“药物–疾病–靶点”网络图( 图2 )，共涉及23个化合物，325个靶点，941条边。根据度值排序排在前五的依次为棕榈油酸(Palmitoleic acid)、槲皮素(Quercetin)、黄芩素(Scutellarein)、十八碳烯酸(Octadecenoic acid)、油酸(Oleic acid)。这些成分可能是银耳调控便秘的核心成分( 表3 )。

在String数据库中输入305个相交靶点，选择物种“Homo sapiens”，设置置信度为≥0.4，再点击MORE进行一次增多，然后进行K-means聚类分析，集群数量设置为3，获得303个靶点，共涉及308个节点和4712条边( 图3 )，最后以TSV格式的文件导出。

使用Cytoscape3.10.3软件中依次使用CytoHCA、CytoHubba和MCODE三种方法来确定重要的蛋白。首先使用CytoHCAc插件，根据DC、BC、CC、EC、LAC和NC的中位数进行3次筛选，得到23个核心基因有雄激素受体(Androgen Receptor, AR)、SRC原癌基因(SRC Proto-Oncogene, Non-Receptor Tyrosine Kinase, SRC)、基质金属蛋白酶9 (Matrix Metallopeptidase 9, MMP9)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma, PPARG)、表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)、白细胞介素1β (Interleukin 1 Beta, IL1B)、Erb-B2受体酪氨酸激酶2 (Erb-B2 Receptor Tyrosine Kinase 2, ERBB2)、雌激素受体1 (Estrogen Receptor 1, ESR1)、肿瘤蛋白P53 (Tumor Protein P53, TP53)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)、前列腺素内过氧化物合酶2 (Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2, PTGS2)、信号转导和转录激活因子3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3, STAT3)、白细胞介素6 (Interleukin 6, IL6)、丝裂原活化蛋白激酶3 (Mitogen-Activated Protein Kinase 3, MAPK3)、B细胞淋巴瘤2 (B-Cell Lymphoma 2, BCL2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase, GAPDH)、小鼠双微体2同源物(Mouse Double Minute 2 Homolog, MDM2)、糖原合成酶激酶3β (Glycogen Synthase Kinase 3 Beta, GSK3B)、胰岛素(Insulin, INS)、核因子κB亚基1 (Nuclear Factor Kappa B Subunit 1, NFKB1)、AKT丝氨酸(AKT Serine, AKT1)、BCL2样1 (BCL2 Like 1, BCL2L1)、丝裂原活化蛋白激酶1 (Mitogen-Activated Protein Kinase 1, MAPK1)。见 图4 。CytoHubba插件按照MCC排序得出10个与疾病相关的hub基因，由高到低依次是STAT3、GAPDH、BCL2、IL6、TP53、TNF、EGFR、AKT1、ESR1、MMP9，见 图5 。利用MCODE插件对蛋白互作网络中的关键模块进行识别，得到了4个模块，筛选出前3个模块，第一个由48个节点、1780条边组成，分数为37.872的模块( 图6 ，MCODE1)，根据MCODE评分，该模块中节点有血管内皮生长因子受体2 (Kinase Insert Domain Receptor, KDR)、血小板衍生生长因子受体β (Platelet Derived Growth Factor Receptor Beta, PDGFRB)、蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型(Protein Tyrosine Phosphatase Receptor Type C, PTPRC)、基质金属蛋白酶2 (Matrix Metallopeptidase 2, MMP2)、丝裂原活化蛋白激酶1 (Mitogen-Activated Protein Kinase 1, MAPK1)；第二个由8个节点、48条边组成，分数为6.86的模块( 图6 ，MCODE2)，该模块中节点有组蛋白甲基转移酶SUV39H1 (Suppressor of Variegation 3-9 Homolog 1, SUV39H1)、组蛋白去乙酰化酶8 (Histone Deacetylase 8, HDAC8)、组蛋白去乙酰化酶5 (Histone Deacetylase 5, HDAC5)、赖氨酸特异性去甲基化酶1A (Lysine Demethylase 1A, KDM1A)、蛋白质精氨酸甲基转移酶1 (Protein Arginine Methyltransferase 1, PRMT1)；第三个由33个节点、216条边组成，分数为6.75的模块( 图6 ，MCODE3)，该模块中节点有吲哚胺2,3-双加氧酶1 (Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1, IDO1)、解整合素金属蛋白酶17 (A Disintegrin And Metalloproteinase 17, ADAM17)、基质金属蛋白酶13 (Matrix Metallopeptidase 13, MMP13)、组蛋白去乙酰化酶4 (Histone Deacetylase 4, HDAC4)、基质金属蛋白酶3 (Matrix Metallopeptidase 3, MMP3)；见 图6 。CytoHCA、CytoHubba和MCODE三种方法总体分析表明STAT3、GAPDH、BCL2、IL6、TP53、TNF、EGFR、AKT1、ESR1、MMP9在不同算法下被确定为关键靶点，表明它们在网络中的重要性。

运用David数据库对银耳、木耳调控便秘相关靶点进行信号通路分析。在Upload列内将共有基因粘贴在列表内，第二步选择“OFFICIAL-GENE-SYMBO0L”和“Homo sapiens”，第三步选择“Gene List”，第四步点击“Submit List”得出结果，共获取187条GO条目，导入excel里，分别选取10个条目运用微生信进行可视化处理绘制柱状图( 图7 )。由 图7 可知，银耳、木耳调控便秘的靶点被功能注释到BP、CC和MF等3个部分。BP主要涉及染色质重塑(chromatin remodeling)、凋亡过程的负调控(negative regulation of apoptotic process)、蛋白质磷酸化(protein phosphorylation)、对外源刺激的反应(response to xenobiotic stimulus)和RNA聚合酶II介导的转录负调控(negative regulation of transcription by RNA polymerase II)等94个条目；CC主要富集于细胞质(cytosol)、受体复合物(receptor complex)、外泌体(extracellular exosome)、膜筏(membrane raft)和质膜(plasma membrane)等23个条目；MF主要体现在核受体活性(nuclear receptor activity)、锌离子结合(zinc ion binding)、同源蛋白结合(identical protein binding)、酶结合(enzyme binding)和组蛋白H3Y41激酶活性(Histone H3Y41 kinase activity)等70个条目。

图4. 潜在靶点调控网络图

利用DAVID在线数据库对银耳、木耳调控便秘靶点进行KEGG通路富集分析，根据P < 0.05筛选出45条通路( 图8 )，选取前30条通路绘制气泡图( 图8 )。银耳、木耳调控便秘靶点涉及多条信号通路，主要涉及癌症相关信号通路(Pathways in cancer)、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、内分泌抵抗(Endocrine resistance)、前列腺癌(Prostate cancer)和化学致癌作用–受体激活(Chemical carcinogenesis-receptor activation)等。

“药物–活性成分–靶点”网络图中排列前5的活性成分分别与PPI网络中筛选出的10个核心蛋白(STAT3, GAPDH, BCL2, IL6, TP53, TNF, EGFR, AKT1, ESR1, MMP9)进行对接。对接盒子x、y、z值均为126，中心值x、y、z分别为−2.257，19.47，24.491。 表4 显示了部分重要对接结果，分子对接展示结合能力最强的前4个结果以三维图形式展示( 图9 )。

图9. 结合能力最强的前4个对接图