SPF级C57BL/6J雄鼠，6~8周龄，体质量20~22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(许可证编号：SYXK (滇) 2018-0002)，小鼠饲养于恒温、标准光照/黑暗循环和60%湿度下饲养，自由饮水和进食。于造模前随机将小鼠分成对照组与TMAO组，每组6只。小鼠Hepa1-6细胞购自赛维尔生物科技有限公司。所有动物实验操作按照中国动物保护利用委员会发布的指导方针进行，本研究经大理大学伦理委员会审核批准。

TMAO (sigma-aldrich)；Hepa1-6细胞专用完全培养基、胰蛋白酶(赛维尔生物科技有限公司)；小鼠白细胞介素1β (interleukin 1β)、IL-18 ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；动物组织总RNA提取试剂盒、逆转录及qPCR试剂盒；组织专用固定液(赛维尔生物科技有限公司)，组织包埋机、切片机及苏木素、伊红染液(大理大学第一附属医院病理科提供)。

Hepa1-6细胞培养，细胞处于对数生长期时重悬细胞，将细胞浓度调整为每10 μl 10⁶个细胞，以每只20 μl原位接种于小鼠肝左叶。小鼠术前禁水粮4 h，称量每只小鼠体重，按0.25 mL/10g体重腹腔注射阿弗丁麻醉后，腹部切口暴露肝左外叶，使用无菌注射器将细胞悬液20 μl接种于肝左叶，干棉球压迫止血后缝合肌肉和皮肤切口。

肝癌细胞移植后第7天开始，TMAO组予腹腔注射TMAO溶液(80 mg/kg)，每周4次，干预3周；对照组腹腔注射TMAO组平均注射体积的生理盐水，每2天记录一次小鼠体重变化。术后第21天，眼球摘除术取血，静置2 h后4℃离心机3000 rpm离心15 min，取上层血清并冻存于−80℃冰箱。后脱颈处死小鼠，解剖并分离出肝脏，PBS冲洗干净，吸干水后称量肝脏质量。留取部分肝组织固定于组织固定液中，其余部分经液氮速冻后放入80℃冰箱保存。

肝组织固定2天后从固定液中取出，脱水后石蜡包埋，切片，行常规HE染色，中性树胶封片，400倍光学显微镜下观察肝组织形态变化，验证肝癌模型的构建。

从−80℃冰箱取出小鼠冰冻血清，冰上融解后用试剂盒中稀释液稀释2倍，根据ELISA试剂盒说明书制备标准品，将标准品与稀释后样本加到预包被酶标板中，待反应结束后显色并在酶标仪450 nm波长处检测吸光值，根据标准曲线及吸光值计算血清中IL-1β、IL-18水平。

称取约50 mg肝脏组织，组织匀浆机震荡匀浆，按照动物组织总RNA提取试剂盒说明书提取肝组织总RNA，使用分光光度计检测RNA样本浓度及纯度。根据样本RNA浓度计算逆转录所需的RNA体积，按照逆转录试剂盒说明书配制20 μl反应体系，设置逆转录程序制备cDNA。根据qPCR试剂盒说明书配制20 μl反应体系，进行qRT-PCR反应。以β-actin为内参基因，采用2^−∆∆CT法分析目的基因的相对表达水平。NLRP3引物序列为正向：5′-GCCGTCTACGTCTTCTTCCTTTCC-3′，反向：5′-CATCCGCAGCCAGTGAACAGAG-3′；caspase-1引物序列为正向：5′-AGGAGGGAATATGTGGG-3′，反向：5′-AACCTTGGGCTTGTCTT-3′；GSDMD引物序列为正向：5′-TGCGTGTGACTCAGAAGACC-3′，反向：5′-CAAACAGGTCATCCCCACGA-3′；β-actin引物序列为正向：5′-TATGCTCTCCCTCACGCCATCC-3′，反向：5′-TGTAGCCACGCTCGGTCAGG-3′。

采用SPSS23.0软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以均数 ± 标准差( $\bar{x}\pm s$)表示，两组间比较采用独立样本t检验或Kruskal-Wallis检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

实验中后期，两组小鼠开始出现精神萎靡，活动与进食减少，体重增加缓慢。与对照组比较，TMAO组小鼠体重偏低，体重增加速度明显低于对照组(P < 0.05)，见 图1 。其次，TMAO组肝脏指数显著高与对照组(P < 0.05)，见 表1 。TMAO组小鼠体重增长缓慢，肝脏指数升高提示TMAO干预后加重了肝癌小鼠肿瘤的负荷。

图2. 两组小鼠肝组织病理变化(HE染色，400×)

HE染色结果显示，小鼠肝癌组织肿瘤细胞排列紊乱，细胞核浆比例增高，核染色深，形态不规则，可见较多胞核分裂象；肝小叶结构明显破坏，肝索排列紊乱；局部见坏死区域，坏死区边缘有大量炎性细胞浸润，见 图2 。HE染色结果表明小鼠肝癌原位模型构建成功。

RT-PCR结果显示，与对照组相比，TMAO组小鼠肝癌组织中的NLRP3、Caspase-1 mRNA表达水平显著增高(P < 0.05)，见 图3 。ELISA检测进一步提示，TMAO组小鼠血清中IL-1β及IL-18水平也明显增加(P < 0.05)，见 图4 。结果表明TMAO可诱导肝癌小鼠NLRP3炎症小体活化，并促进IL-1β、IL-18的成熟。

图3. 两组小鼠肝癌组织中NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达水平(^*P < 0.05)

图4. 两组小鼠血清IL-1β及IL-18水平比较(^*P < 0.05)

GSDMD作为焦亡相关蛋白家族的重要成员之一，可被caspase-1裂解并进一步诱导细胞焦亡，释放细胞内IL-1β、IL-18等炎症因子。为进一步了解TMAO激活NLRP3炎症小体后是否影响其下游基因GSDMD表达，本研究检测了GSDMD mRNA表达情况。结果表明，TMAO干预后同样增强了小鼠肝癌组织中GSDMD mRNA表达(P < 0.05)，见 图5 。结合上述实验中，血清IL-1β、IL-18水平增加，提示TMAO可通过GSDMD诱导细胞焦亡。