宋超¹，吕杨^1,2，赵峰¹，侯俊利¹，杨刚¹，庄平^1,2

¹中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与长江口渔业资源环境科学观测实验站，上海

²南京农业大学无锡渔业学院，江苏 无锡

收稿日期：2016年11月27日；录用日期：2016年12月16日；发布日期：2016年12月19日

为了对比线粒体16S rRNA和COI基因片段在长江口虾虎鱼科鱼类种类鉴定和系统分类研究中的适用性，本文运用PCR技术，扩增了虾虎鱼科7属8种24个个体的线粒体16S rRNA和COI基因片段，并对其种间的序列差异进行比较分析。经比对后得到16S rRNA基因长度为535bp的序列，共编码178个氨基酸，24条16S rRNA序列共有12个单倍型，共检测到变异位点161个，约占总位点数的30.1%，插入/缺失位点15个，转换与颠换比值(Si/Sv)为1.51；同时，获得COI基因长度641 bp，共编码213个氨基酸，单倍型个数与16S rRNA序列相同，变异位点221个，所占百分比高于16S rRNA序列(约34.5%)，无插入/缺失位点，转换/颠换值为1.29。两种基因的转换/颠换值均小于2，因此对其做了相应的突变饱和性分析，结果显示，两种基因在虾虎鱼科鱼类中不存在突变饱和现象。遗传距离结果显示，16S rRNA基因种间序列变异程度均小于COI基因，16S rRNA基因的种内和种间平均遗传距离分别为0.002和0.169，种间约为种内遗传距离的84倍，种间遗传距离最小值存在于纹缟虾虎鱼和髭缟虾虎鱼之间为0.100；而COI序列的种内和种间平均遗传距离分别0.001和0.215，种间为种内遗传距离的215倍。因此，16S rRNA和COI序列均适用于虾虎鱼科的种类鉴定。基于16S rRNA和COI基因序列获得的UPGMA系统树显示虾虎鱼科鱼类均可形成单系群，不同之处在于16S rRNA基因序列主要表现种、属间序列差异，而COI则突出表现种、属、科间序列差异。因此，在应用这两种基因片段做系统分类研究时，应根据研究的不同系统水平选择适当的分子标记。

关键词 :长江口，虾虎鱼科，16S rRNA，COI，种类鉴定，系统分类

虾虎鱼科(Gobiidae)鱼类隶属鲈形目、虾虎鱼亚目，是现存的鲈形目鱼类中最大的一个类群，中国现有虾虎鱼类9科5亚科106属307种，约占世界虾虎鱼类总数的14% [ 1 ] 。虾虎鱼类是以暖水性为主的海洋或淡水小型鱼类，主要以摄食小鱼和虾为主，是中华鲟幼鱼索饵洄游的主要饵料生物，在长江口生态系统中具有重要地位 [ 2 ] 。虾虎鱼类体态变异大，体型微小，其早期形态存在较多相似性，在传统形态学鉴定中存在较多困难，导致其在种类的命名及系统分类关系上存在较大争议。目前，线粒体基因由于其具有结构简单，进化较快等优点，在动物种群的种质鉴定和系统分类研究中具有重要作用 [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] 。其中，16S rRNA和COI基因序列均具有较强的种间鉴别能力，已被广泛应用于鱼类的鉴定、分类和系统演化等研究中 [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] 。

本研究通过对比16S rRNA和COI基因部分序列在不同分类阶元中的序列变异，对长江口8种虾虎鱼类早期资源进行种类鉴定和系统进化分析，对比线粒体16S rRNA和COI基因片段在虾虎鱼科鱼类系统分类中的适应性，以期为虾虎鱼科鱼类的物种鉴定和系统分类筛选适当的分子标记。

已有研究表明线粒体不同基因的进化速率存在差异 [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] 。在线粒体基因组中16s rRNA基因较为保守，进化速率较慢，而COI基因的变异性则相对较大 [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] 。本研究中在虾虎鱼科8种24个个体的16S rRNA基因序列中共检测到161个碱基变异，约占30.1%；而在COI序列中发现变异位点221个，占34.5%，可见COI基因进化速率相对16S rRNA基因较快，进一步证实16S rRNA基因相对保守这一结论。同时，本研究中16S rRNA和COI基因序列全部转换与颠换个数的比值分别为1.51和1.29，均小于2。但通过对其进行碱基突变饱和性分析，虾虎鱼科鱼类基因序列的碱基替代速率同遗传距

图2. 2种基因在不同分类阶元的K2P遗传距离分布箱型图

图3. 基于16S rRNA (a)和COI (b)部分基因序列构建虾虎鱼科鱼类的UPGMA树

离进行比较的结果显示这两种基因中无论转换还是颠换都没有达到饱和，因此它们能够用于虾虎鱼科鱼类的分子系统分类分析，该结果与孙希褔等 [ 18 ] 对10种虾虎鱼类的研究结果一致。

Asakawa等 [ 19 ] 提出后生动物线粒体基因的碱基构成具有明显的偏倚性，通常表现为A + T含量显著高于G + C含量。本研究8种虾虎鱼科鱼类的16S rRNA和COI序列的A+T含量均明显高于G + C含量，进一步验证了上述偏倚性的特征 [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] 。Saccone等 [ 20 ] 分析后生动物的线粒体基因组全序列得出，硬骨鱼类的平均G + C含量(43.2%)显著高于软骨鱼类(38.4%)。本研究中虾虎鱼科鱼类的16S rRNA和COI基因序列平均G + C含量分别为47.8%和45.8%，均显著高于软骨鱼类的平均G + C含量，符合硬骨鱼类的序列组成特征。此外，COI基因序列密码子3个位点中的碱基组成有显著差异，表明COI序列密码子间的碱基使用频率存在明显的偏向性。

从遗传距离角度分析，种内和种间遗传距离的大小是进行种类鉴定的重要依据。Hebert等 [ 21 ] 认为COI序列在物种间的遗传差异通常大于0.02，并提出当种间遗传距离与种内遗传距离的差异达到10倍以上时，COI基因才可对物种进行有效的鉴定，这一观点已在许多物种的研究中得到了验证 [ 22 ] [ 23 ] [ 24 ] 。本研究通过对比分析16S rRNA和COI基因序列，得出种内平均遗传距离分别为0.002和0.001，种间平均遗传距离分别为0.169和0.215，种间遗传距离远大于种内遗传距离，因此，16S rRNA和COI基因序列均能有效地对长江口虾虎鱼科鱼类进行物种鉴定。但从表5可以看出，16S rRNA序列间的种间平均遗传距离明显小于COI序列，由此可见，COI基因在种间的趋异性要明显高于16S rRNA基因，进一步说明在本研究的虾虎鱼科鱼类中，COI基因的进化速率相对较快，16S rRNA基因则相对保守些。

本研究分子系统图谱的拓扑结构显示，两种基因序列的虾虎鱼科鱼类均为明显的单系群，其中虾虎鱼类的分支中包括了以传统分类标准划分的弹涂鱼科的青弹涂鱼以及鳗虾虎鱼科的拉氏狼牙虾虎鱼 [ 25 ] 。从亲缘关系来看，上述两种鱼类与其它虾虎鱼类的亲缘关系密切，均可归为虾虎鱼科。该划分与伍汉霖等 [ 1 ] 主编的《中国动物志》中对以上两种鱼类的分类结果一致。在16S rRNA基因的亲缘关系图谱中显示，髭缟虾虎鱼和纹缟虾虎鱼形成姊妹分支，其遗传距离只有0.100，说明两者亲缘关系较近，同属于缟虾虎鱼属 [ 1 ] ；而在COI基因的亲缘关系图谱中显示，亲缘关系较近的为睛尾蝌蚪虾虎鱼和斑尾刺虾虎鱼，二者间的遗传距离也最小，仅为0.189。该结果与于亚男等 [ 2 ] 的研究结果相符，但在基于COI亲缘关系图谱中除了髭缟虾虎鱼与纹缟虾虎鱼聚在一起外，该分支中还包括青弹涂鱼、拉氏狼牙虾虎鱼和子陵吻虾虎鱼，表明这5种虾虎鱼在COI基因中近缘关系相对较近，不能把不同属的虾虎鱼进行有效区分。可见，16S rRNA基因较COI基因在虾虎鱼属水平上有更好的种类分辨能力。

据相关文献报道，已有许多学者利用16S rRNA和COI基因部分序列对多种物种进行了种间系统进化关系分析，将两种基因在同一物种中进行适用性的比较等相关研究 [ 17 ] [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ] 。本研究通过对线粒体16S rRNA和COI基因片段的遗传特性及其在虾虎鱼科鱼类种类鉴定和系统分类中的适用性进行对比，结果表明，在长江口虾虎鱼科鱼类中，16S rRNA基因序列的碱基变异率明显低于COI基因，进一步证实了COI基因的进化速率相对较快，16S rRNA基因则相对保守这一结论。有研究表明16S rRNA基因在一些近缘种的区分上存在困难，不适用于种水平的物种鉴定，然而在另外一些动物类群中，16S rRNA基因却被证明有相对较高的变异水平 [ 14 ] [ 30 ] 。本研究表明，16S rRNA基因和COI基因序列均能有效地对长江口虾虎鱼科鱼类进行物种鉴定，但相对于COI基因来说，16S rRNA基因在虾虎鱼科属的水平上有较好的物种鉴别能力，因此，在应用这两种基因片段进行系统分类研究时，应根据研究的不同系统水平选择适当的分子标记。

东海水产种质资源标准化整理、整合与共享。

宋 超,吕 杨,赵 峰,侯俊利,杨 刚,庄 平. 16S rRNA和COI基因序列对长江口虾虎鱼科鱼类种类鉴定和系统分类的对比研究 Comparative Study of Mitochondrial 16S rRNA and COI Gene Sequences in Species Identification and Phylogeny of Gobiidae from Yangtze Estuary[J]. 水产研究, 2016, 03(04): 71-81. http://dx.doi.org/10.12677/OJFR.2016.34012