目的:建立一次测定刺五加中刺五加苷E、异嗪皮啶、绿原酸、原儿茶酸和齐墩果酸的含量的方法。方法 采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)法。质谱条件:采用电喷雾离子源,正离子扫描模式,多离子反应监测扫描方式;采用外标法进行定量分析。结果:刺五加苷E、异嗪皮啶、绿原酸、原儿茶酸和齐墩果酸五种物质的含量分别在10~10,000 mg/mL、0.1~5000 mg/mL、1~10,000 mg/mL、 0.1~ 10,000 mg/mL 和100~30,000 mg/mL浓度范围内,线性关系良好,R2均 > 0.9993;加标实验回收率在94.67%~98.03%之间。结论 此方法灵敏度高、选择性好、分析时间短,可以对刺五加中刺五加苷E、绿原酸、齐墩果酸、异嗪皮啶和原儿茶酸进行准确的定量分析。 Objective: To establish an UPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of eleutheroside E, sofraxidin, chlorogenic acid, protocatechuate and oleanolic acid in Acanthopanax Stems and leaves. Methods: water-methanol is used as mobile phase to operate gradient elution; Flowing Speed: 0.25 mL/min; Temperature: 25˚C; Injection volume: 10 μL. Mass Condition: ESI ion source, positive, MRM scanning mode is used, and external standard method is used to ration. Results: eleutheroside E, sofraxidin, chlorogenic acid, protocatechuate and oleanolic acid have good linear relationship by the range of 10 - 10,000 mg/mL, 0.1 - 5000 mg/mL, 1 - 10,000 mg/mL, 0.1 - 10,000 mg/mL and 100 - 30,000 mg/mL respectively, and R2 > 0.9993 in all over. The spiked recovery is between 94.67% - 98.03%. This method is successfully applied to measure the contents of target compound in wild and cropped Acanthopanax senticosus (Rupr. Maxim.) Harms stem and leaf. Conclusions: This method has the advantages of high sensitivity, good selectivity and shorter analysis time, and can be applied to make accuracy quantitative analysis for the eleutheroside E, sofraxidin, chlorogenic acid, protocatechuate and oleanolic acid in Acanthopanax.
徐绍娣1,崔宝国1,赵桂香1,张玉香1,尹军1,邱东法1,杨延辉1,包龙琦1,刘真才1, 刘佳2,唐中华2*
1黑龙江省兴隆林业局,黑龙江 哈尔滨
2东北林业大学,黑龙江 哈尔滨
Email: *tangzh@nefu.edu.cn
收稿日期:2017年6月11日;录用日期:2017年6月26日;发布日期:2017年7月3日
目的:建立一次测定刺五加中刺五加苷E、异嗪皮啶、绿原酸、原儿茶酸和齐墩果酸的含量的方法。方法 采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)法。质谱条件:采用电喷雾离子源,正离子扫描模式,多离子反应监测扫描方式;采用外标法进行定量分析。结果:刺五加苷E、异嗪皮啶、绿原酸、原儿茶酸和齐墩果酸五种物质的含量分别在10~10,000 mg/mL、0.1~5000 mg/mL、1~10,000 mg/mL、 0.1~ 10,000 mg/mL 和100~30,000 mg/mL浓度范围内,线性关系良好,R2均 > 0.9993;加标实验回收率在94.67%~98.03%之间。结论 此方法灵敏度高、选择性好、分析时间短,可以对刺五加中刺五加苷E、绿原酸、齐墩果酸、异嗪皮啶和原儿茶酸进行准确的定量分析。
关键词 :超高效液相色谱–质谱联用(UPLC-MS/MS),刺五加,刺五加苷E,异嗪皮啶,绿原酸, 原儿茶酸,齐墩果酸
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刺五加(Acanthopanax senticosus (Rupr. Maxim.) Harms)是五加科(Araliaceae)刺五加属(Acanthopax)的落叶灌木,分布于东北地区和河北、山西,生于海拔800 m以下(东北)至1500~2000 m (华北)处的针阔混交林内 [
《本草纲目》称刺五加为“本经上品”,能“补中益气,坚筋骨,强意志,久服轻身耐老”。民间有“宁得一把五加,不用金玉满车”的说法 [
刺五加采于吉林省延吉市八家子镇泉水洞林场野生刺五加茎、叶和人工栽培刺五加茎、叶,实验前使用粉碎机粉碎至粉末,将粉末过20目筛备用;刺五加苷E、异嗪皮啶、绿原酸、原儿茶酸和齐墩果酸化学结构式如图1所示,五种标准品(纯度均 ≥ 98%)均购于中国药品生物制品检定所;色谱级甲醇、乙腈均购于北京百灵威公司;色谱甲酸购买于美国Sigma公司;去离子水用超纯水仪自制。
图1. 目标化合物的化学结构式。(a)刺五加苷E;(b)异嗪皮啶;(c)绿原酸;(d)原儿茶酸;(e)齐墩果酸
Qtrap5500质谱仪,配有电喷雾电离源(美国AB公司),串联超高效液相色谱仪(日本沃特斯公司),使用LC-20AD泵,温度控制器,柱温箱,SIL-20A自动进样器;FZ-06中药粉碎机浙江温岭市百乐粉碎设备厂;250DC型数控超声波清洗器 江苏昆山超声仪器有限公司;BS124S电子天平 德国Sartorius公司;Millipore超纯水仪 法国Millipore公司。
取野生刺五加和人工种植刺五加茎、叶粉末各0.5 g,加入甲醇20 mL超声提取(100 kHz,40℃) 30 min,过滤后将残渣再加入20 mL溶剂超声提取30 min,过滤后合并两次滤液,测定前用0.45 µm的微孔滤膜过滤。
精密称取刺五加苷E、异嗪皮啶、绿原酸、原儿茶酸和齐墩果酸标准品各适量,置50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。配制成1 mg/mL的标准品溶液,于4℃冰箱中保存备用,使用前根据需要用流动相配成标准工作液。
1) 色谱条件
流动相:A% -甲醇,B%-水;25% B (0~1.5 min),25%~50% B (1.5~2 min),50% B (2~4 min),50%~90% B (4~4.5 min),90% B (4.5~5.5 min),90%~25% B (5.5~6 min),25% B (6~7 min);色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18 Column(1.7 μm, 2.1 mm × 50 mm);流速:0.25 mL/min;柱温:25℃;进样量:10 µL。
2) 质谱条件
采用电喷雾离子源(electrospray ionization, ESI),正离子扫描模式,多离子反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)扫描方式;锥孔电压是3 KV;离子源雾化温度5000℃;雾化气25 psi,气帘气15 psi。
准确吸取刺五加苷E、异嗪皮啶、绿原酸、原儿茶酸和齐墩果酸标准品溶液连续进样6次,计算峰面积RSD。考察仪器的精密度。
取野生和人工刺五加茎、叶实样品溶液,室温放置24 h内不同时间进样,分别计算5种目标化合物的RSD,考察样品在稳定性。
取6份野生刺五加和短梗五加茎、叶,分别按1.3.1项方法进行样品制备后得到6组平行样品,分别进样后计算峰面积RSD值,考察此方法的重现性。
将五种标准品溶液用流动相稀释成不同浓度的工作液,按上述LC-MS/MS方法分别进行检测,将标准品工作液浓度(x)与峰面积(y)进行线性回归,得到回归方程和相关系数(R2),确定线性范围。
分析前将滤液经0.45 μm滤膜过滤后进行LC-MS/MS测定,按下列公式计算各物质含量:
式(1)中:t为提取量(mg/mL);c为提取液测得的质量浓度/(mg/mL);v为提取液体积/mL;m为刺五加叶片质量/g。
相同提取条件下,每个样品重复3次,实验结果取平均值,采用SPSS 18.0对其做方差,差异性和主成分Q值分析,SigmaPlot 10.0用于绘制数据图像。
分别在电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI)正、负离子扫描模式下对刺五加苷E、绿原酸、齐墩果酸、异嗪皮啶、原儿茶酸标准品进行扫描,结果5种物质在正离子扫描模式下电离信号明显高于负离子扫描模式,因此采用正离子扫描模式,对野生刺五加和人工刺五加茎、叶的5种化合物进行质谱分析,多离子反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)扫描方式。通过对质谱条件的优化得出最优的质谱条件为:锥孔电压是3 KV;离子源雾化温度5000℃;雾化气25 psi,气帘气15 psi;5种主要药用次生代谢物碎片离子、去簇电压、碰撞电压、碰撞室射出电压见表1。
在此条件下,5种物质的质谱信号最强。对高效液相的流动相的组成和比例进行了考察,结果表明使用水–甲醇溶液为流动相的组成梯度洗脱时,分离效果好,灵敏度高,梯度洗脱(表2)。
名称 | m/z | DP | CE | CXP |
---|---|---|---|---|
刺五加苷E | 765.3 → 603.1 | 70 | 62 | 23 |
异嗪皮啶 | 223.1 → 206.3 | 60 | 40 | 9 |
绿原酸 | 355 → 162.7 | 50 | 18 | 5 |
齐墩果酸 | 479.3 → 435.5 | 70 | 28 | 17 |
原儿茶酸 | 155 → 92.9 | 70 | 21 | 17 |
表1. 5种目标化合物的质谱分析条件参数
A1 | B1 | |
---|---|---|
Time | A%水 | B%甲醇 |
0 | 75 | 25 |
1.5 | 75 | 25 |
2 | 50 | 50 |
4 | 50 | 50 |
4.5 | 10 | 90 |
5.5 | 10 | 90 |
6 | 75 | 25 |
7 | 75 | 25 |
表2. 梯度洗脱程序
对流动相组成进行考察,结果表明流动相中使用水–甲醇溶液为流动相的组成梯度洗脱时,分离效果好,灵敏度高,同时色谱峰的峰形更加尖锐,并能有效地减少拖尾现象的产生。由图2可知,采用上述LC-MS/MS方法对样品进行检测,获得色谱图2,绿原酸的色谱保留时间0.60 min;原儿茶酸的保留时间为0.86 min;刺五加苷E的保留时间为2.69 min;异嗪皮啶的保留时间为2.76 min;齐墩果酸的保留时间为5.66 min。
将五加苷E、绿原酸、齐墩果酸、异嗪皮啶和原儿茶酸标准品连续进样6次,计算峰面积RSD,分别为0.65%、0.44%、1.26%、2.11%和2.25% (表3),表明仪器的精密度良好;取刺五加茎、叶实样品溶液,室温放置24h内不同时间进样,测定峰面积计算RSD,五加苷E、绿原酸、齐墩果酸、异嗪皮啶和原儿茶酸在室温条件下24 h内的峰面积RSD分别为0.66%、0.05%、0.79%、0.58%和0.79% (表3),表明样品在室温24 h内稳定;取6份野生刺五加和短梗五加茎、叶,分别按1.3.1项方法进行样品制备后得到6组平行样品,分别进样后计算峰面积RSD值,五加苷E、绿原酸、齐墩果酸、异嗪皮啶、原儿茶酸峰面积RSD分别为0.85%、0.36%、2.30%、2.30%和0.23% (表3),说明此方法重现性好;取6份刺五加果实样品溶液,加入适量已知浓度的标准品溶液后,分别按1.3.1项方法制备样品,分别进样后计算两种物质的平均回收率和RSD,结果表明五加苷E、绿原酸、齐墩果酸、异嗪皮啶、原儿茶酸的平均加标回收率为96.21%、97.02%、96.66%、95.74%、97.03%,RSD为0.85%、0.81%、1.17%、1.04%、0.95% (表4)。
图2. 目标化合物的MRM色谱图。1. 绿原酸;2. 原儿茶酸;3. 刺五加苷E;4. 异嗪皮啶;5. 齐墩果酸
化合物名称 | RSD(%) | ||
---|---|---|---|
精密度 | 重复性 | 稳定性 | |
刺五加苷E | 0.65% | 0.85% | 0.66% |
异嗪皮啶 | 0.44% | 0.36% | 0.05% |
绿原酸 | 1.26% | 2.30% | 0.79% |
齐墩果酸 | 2.11% | 2.30% | 0.58% |
原儿茶酸 | 2.25% | 0.23% | 0.79% |
表3. 精密度、重复性、稳定性结果
化合物名称 | 样品原含量 (ng/mL) | 标准品加入量 (ng/mL) | 测定量 (ng/mL) | 回收率 (%) | 平均回收率 (%) | RSD (%) |
---|---|---|---|---|---|---|
刺五加苷E | 5190 | 500 | 5489 | 96.47% | ||
1000 | 5996 | 96.87% | 96.21% | 0.85% | ||
1500 | 6375 | 95.29% | ||||
异嗪皮啶 | 1240 | 500 | 1679 | 96.49% | ||
1000 | 2165 | 96.65% | 97.02% | 0.81% | ||
1500 | 2683 | 97.92% | ||||
绿原酸 | 3461 | 500 | 3876 | 97.85% | ||
1000 | 4351 | 95.61% | 96.66% | 1.17% | ||
1500 | 4789 | 96.53% | ||||
原儿茶酸 | 119 | 50 | 160 | 94.67% | ||
100 | 210 | 95.89% | 95.74% | 1.04% | ||
150 | 260 | 96.65% | ||||
齐墩果酸 | 8240 | 500 | 8464 | 96.84% | ||
1000 | 9058 | 98.03% | 97.03% | 0.95% | ||
1500 | 9371 | 96.21% |
表4. 提取回收率
在上述分析方法条件下取五加苷E、绿原酸、齐墩果酸、异嗪皮啶和原儿茶酸标准品溶液进行LC-MS/MS分析,将浓度和峰面积(3次平均值)进行线性回归,得到回归方程和相关系数,结果见表5。结果表明,刺五加苷E、异嗪皮啶、绿原酸、原儿茶酸、齐墩果酸线性范围:10~10,000 mg/mL、0.1~5000 mg/mL、1~10,000 mg/mL、0.1~10,000 mg/mL 和100~30,000 mg/mL范围内线性关系良好,R2均 > 0.9993。
经过优化提取条件,野生刺五加叶中特异性物质刺五加苷E含量大于人工种植刺五加,具有显著性差异(p < 0.05),分别为0.068 ± 0.01 μg∙g−1和0.029 ± 0.006 μg∙g−1;异嗪皮啶野生中含量高于人工种植,具有显著性差异(p < 0.05),分别为0.025 ± 0.007 μg∙g−1和0.007 ± 0.001 μg∙g−1;绿原酸野生中含量高于人工种植,无显著性差异,分别为0.031 ± 0.008 μg·g−1和0.025 ± 0.008 μg∙g−1;原儿茶酸野生种植小于人工种植含量,具有显著性差异(p < 0.05),分别为2.252 ± 0.94 μg∙g−1和3.952 ± 0.73 μg∙g−1;齐墩果酸野生种植小于人工种植含量,具有显著性差异(p < 0.05),分别为3.087 ± 0.04 μg·g−1和2.507 ± 0.93 μg∙g−1;结果见图3。
从图4可以看出野生刺五茎中五种物质含量均大于人工种植刺五加,具有显著性差异(p < 0.05),从图由左到右野生刺五加五种含量分别是3.650 ± 0.83 μg∙g−1、2.140 ± 0.85 μg∙g−1、2.546 ± 3.72 μg∙g−1、0.380 ± 0.12 μg∙g−1、4.574 ± 1.53 μg∙g−1;人工刺五加的含量分别为1.540 ± 0.52 μg∙g−1、0.020 ± 0.007 μg∙g−1、0.359 ± 0.15 μg∙g−1、0.872 ± 0.14 μg∙g−1、2.574 ± 0.62 μg∙g−1。
图3. 野生刺五加和人工刺五加叶中的5种主要物质的含量
图4. 野生刺五加和人工刺五加茎中的5种主要酚酸类化合物的含量
化合物 | 回归方程(y = ax + b) | 相关系数(R2) | 线性范围(ng/mL) |
---|---|---|---|
刺五加苷E | y = 4E + 10x + 183557 | R2 = 0.9999 | 10~10,000 |
绿原酸 | y = 2E + 08x + 64305 | R2 = 0.9998 | 1~10,000 |
齐墩果酸 | y = 3E + 07x + 37388 | R2 = 0.9993 | 100~30,000 |
异嗪皮啶 | y = 7E + 07x + 5358.3 | R2 = 1 | 0.1~5000 |
原儿茶酸 | y = 2E + 08x + 33494 | R2 = 1 | 0.1~10,000 |
表5. 回归方程、相关系数及线性范围结果(n = 3)
由图5可以看出五种目标化合物总体上在野生刺五加茎和叶中较大量的积累,相比于人工种植刺五加,野生刺五加在这五种化合物的积累上更有优势。
图5. 野生刺五加和人工刺五加茎中5种目标化合物综合分析
LC-MS/MS检测方法可以实现同时检测提取液中的多种成分,由于MRM检测方法是跟踪化合物分子离子及主要碎片峰,可以排除杂质的干扰,使检测更加灵敏更快速,可以在较短时间内实现对化合物的定量分析。本实验建立了LC-MS/MS法测定刺五加茎和叶中刺五加苷E、异嗪皮啶、绿原酸、原儿茶酸和齐墩果酸含量的方法,经过方法学考察,此方法可快速、灵敏地实现刺五加中五种目标化合物的准确定量分析。测定结果表明,刺五加苷E、异嗪皮啶、绿原酸、原儿茶酸和齐墩果酸在野生刺五加茎中的含量分别为 3.650 ± 0.83 μg∙g−1、2.140 ± 0.85 μg∙g−1、2.546 ± 3.72 μg∙g−1,0.380 ± 0.12 μg∙g−1和4.574 ± 1.53 μg∙g−1,在人工种植刺五加茎中分别为 1.540 ± 0.52 μg·g−1,0.020 ± 0.007 μg∙g−1,0.359 ± 0.15 μg∙g−1,0.872 ± 0.14 μg·g−1和2.574 ± 0.62 μg·g−1。在野生刺五加叶中含量分别为0.0680.01 μg∙g−1,0.025 ± 0.007 μg·g−1,0.031 ± 0.008 μg·g−1,2.252 ± 0.94 μg∙g−1和3.087 ± 0.04 μg∙g−1,在人工刺五加叶片中分别为0.029 ± 0.006 μg∙g−1,0.007 ± 0.001 μg∙g−1,0.025 ± 0.008 μg∙g−1,3.952 ± 0.73 μg∙g−1和2.507 ± 0.93 μg∙g−1。此外,发现刺五加特异性活性物质刺五加苷E和异嗪皮啶均在野生刺五加中更好地积累,而其他酚酸类成分在人工种植刺五加中含量较高。已有报道在刺五加研究中多使用HPLC方法对目标化合物进行检测 [
中央财政林业科技推广示范资金项目([
徐绍娣,崔宝国,赵桂香,张玉香,尹军,邱东法,杨延辉,包龙琦,刘真才,刘佳,唐中华. LC-MS/MS同时测定刺五加中刺五加苷E、异嗪皮啶、绿原酸、原儿茶酸和齐墩果酸的含量Simultaneous Determination of Eleutheroside E, Isothiazine, Chlorogenic Acid, Protocatechuic Acid and Oleanolic Acid in Acanthopanax by LC-MS/MS[J]. 植物学研究, 2017, 06(04): 201-210. http://dx.doi.org/10.12677/BR.2017.64026