韩立芬，宋善敏，邓伟，甘梦兰，王仁凤，杨再昌*
贵州大学药学院，贵州 贵阳
收稿日期：2017年7月11日；录用日期：2017年7月29日；发布日期：2017年8月1日
结核病是迄今为止最难控制的传染病之一，且近年来呈上升趋势。中药是新药发现的重要来源之一，且在我国储存量大。本试验选取29种中草药，分别对结核分枝杆菌H37Rv和牛分枝杆菌BCG菌株进行活性筛选，发现14种中草药具有抗结核杆菌作用，其中9种中草药与异烟肼和利福平存在协同抗菌作用，首次发现三角条具有抗结核杆菌活性。研究结果为发现新型抗结核杆菌分子骨架奠定了基础。 Tuberculosis is one of common infectious diseases that has been difficult to control so far and has been on the rise in recent years. Chinese herbal medicine is an important natural resource for the discovery of new drug, and China has a wealth of natural medicine resources. In this experiment, 29 traditional Chinese medicines were selected for the screening of anti-M tuberculosis H37Rv and BCG respectively. The results indicated that 14 kinds of herbs showed powerful activity against Myco-bacterium tuberculosis H37Rv and BCG. Among them, 9 kinds of Chinese herbal medicine exhibited synergistic antibacterial effect combined with isoniazid and rifampicin respectively. In addition, it was first discovered that the Sanjiaotiao (Chinese name) had anti-Myco bacterium tuberculosis activity. The study laid the foundation for the discovery of the new skeleton of anti-Mycobacterium tuberculosis drug.
韩立芬，宋善敏，邓伟，甘梦兰，王仁凤，杨再昌*
贵州大学药学院，贵州 贵阳
收稿日期：2017年7月11日；录用日期：2017年7月29日；发布日期：2017年8月1日
结核病是迄今为止最难控制的传染病之一，且近年来呈上升趋势。中药是新药发现的重要来源之一，且在我国储存量大。本试验选取29种中草药，分别对结核分枝杆菌H37Rv和牛分枝杆菌BCG菌株进行活性筛选，发现14种中草药具有抗结核杆菌作用，其中9种中草药与异烟肼和利福平存在协同抗菌作用，首次发现三角条具有抗结核杆菌活性。研究结果为发现新型抗结核杆菌分子骨架奠定了基础。
关键词 :结核杆菌，中草药，活性筛选
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结核是一种由结核分枝杆菌引起的仅次于艾滋病的世界第二大致命传染病。主要通过空气经呼吸道传播，以肺结核为主，但结核杆菌几乎可以在身体任何部位引起疾病，被称为白色瘟疫。肺结核病人的主要症状包括咳嗽、发烧、盗汗和体重减轻等，感染者如果抵抗力下降或出现耐药时，可导致病情恶化，呼吸极为困难，最终死于肺咯血。根据WHO的统计分析，全世界约1/3的人口感染了结核分枝杆菌，成为全球性的公共卫生问题。中国是全球22个结核病高负担国家，具有高患病率、高耐药率、高感染率、低递降率、青壮年结核病患病和死亡比例高、农村疫情高于城市等流行特点 [
一线抗结核药物主要有异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺，在药物的选择压力下，结核杆菌出现耐药菌株，中国有四分之一的活动型结核病人对异烟肼和利福平耐药，而耐多药结核(MDR-TB)和广泛耐药结核(XDR-TB)的出现给结核病的防控和治疗带来严峻挑战 [
相比其它药物，抗结核杆菌药物的研发严重滞后，近40年来只有一个全新结构的抗结核药物(贝达喹啉)上市 [
结核分枝杆菌H37Rv、牛结核分枝杆菌BCG菌株(购自ATCC)。
甲醇、80%的乙醇、石油醚、乙酸乙酯、二甲基亚枫、利福平、异烟肼、甘油、改良罗氏培养基基础。
所有中草药购自贵阳市和平药房。中草药名称、传统药效、药用部位和提取物的制备方法见表1。
采用药基法进行。改良罗氏培养基40.84 g，加入12 ml的甘油，加蒸馏水600 ml煮沸5~10分钟，115℃ 20分钟灭菌，待冷至55℃左右时以无菌操作加入1000 ml无菌搅匀的全蛋液，混匀，分装在15 mm × 150 mm的试管，每管5 ml。中草药提取物样本用DMSO配成母液，加入到试管中，每个样本配4个浓度，分别为10、5、2.5、1.25 mg/ml，异烟肼为阳性对照(0.5、1、2 μg/ml)，阴性对照为含5% DMSO的无药培养基，放置成斜面，用85℃流动蒸汽加热50分钟后冷却待用，分别接种H37Rv、BCG菌悬液(108 CFU/ml) 20 μl后，置于36.5℃的恒温培养箱中培养20天。每个浓度做3管，平行做2次。培养结束后，试管斜面菌落数小于5个(含5个)视为有效，此时的样本浓度即为该样本抗结核杆菌的MIC值。MIC值大于10 mg/ml的样本视为无抗结核杆菌活性 [
为探索有抗结核杆菌活性的中草药样本是否与异烟肼、利福平存在协同作用，进行了联合抗菌试验。本试验经测试得知，利福平、异烟肼抗BCG的MIC值分别为为3.2 μg/ml和1.0 μg/ml。含药培养基的制备方法同上，分组如下，联合抗菌组：异烟肼(1/2 MIC) + 中草药样本(1/2 MIC)、利福平(1/2 MIC) + 中草药样本(1/2 MIC)；阳性药对照组：异烟肼(MIC)利福平(MIC)；阳性药亚抑菌浓度组：异烟肼(1/2 MIC)、利福平(1/2 MIC)；中草药亚抑菌浓度组：中草药样本(1/2 MIC)。按上述方法，培养结束后，试管斜面菌落数小于5个(含5个)视为有联合作用，标记为“+”，6个菌落以上视为无联合作用，标记为“−”。
29种中草药提取物，有14种表现出抗结核杆菌活性(表1)。其中千里光、大蓟、三角条、山茱萸、杜仲、秦皮、苦参、玉竹、远志、白术、半夏的MIC值为2.5 mg/ml，夏枯草、金银花、蒲公英的MIC值为2.5 mg/ml。大蓟抗结核杆菌H37Rv的MIC值为2.5 mg/ml，但是牛结核杆菌BCG对大蓟更为敏感，MIC值为1.25 mg/ml。除大蓟外其余13种中草药抗H37Rv和BCG的MIC值没有差异。
具有抗牛结核杆菌BCG活性的14种中草药提取物，在亚抑菌浓度(1/2 MIC)下没有抗菌活性，阳性药异烟肼和利福平在亚抑菌浓度(1/2 MIC)下同样未能抑制BCG菌株的生长。在培养基中加入亚抑菌浓度的中草药提取物和亚抑菌浓度的阳性药，结果显示(表2)，大蓟、远志、千里光、三角条、杜仲、秦皮、半夏、苦参、蒲公英与异烟肼和利福平都存在协同抗菌作用，山茱萸、玉竹、白术仅与异烟肼存在协同抗菌作用，金银花、夏枯草与异烟肼和利福平都不存在协同抗菌作用。
从上世纪50年代开始，我国医药工作者对抗结核中草药进行过大量研究，其中郭钧等对266种单味中草药进行了抗结核杆菌试验 [
| 名称 | 科 | 传统功效 | 药用部位 | 提取方法 | MIC (mg/ml) | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| H37Rv | BCG | |||||
| 千里光 | 菊科 | 清热解毒、明目、止痒 | 全草 | 80%的乙醇热回流(80℃)提取两次，滤液回收乙醇蒸干。 | 2.5 | 2.5 |
| 鸡屎藤 | 茜草科 | 利湿祛风，止血止痛 | 根 | 同上 | > 10 | > 10 |
| 牛膝菊 | 菊科 | 抗炎止血 | 全草 | 同上 | > 10 | > 10 |
| 葛根 | 豆科 | 用于表证发热、项背强痛、麻疹不透 | 根 | 同上 | > 10 | > 10 |
| 夏枯草 | 唇形科 | 清肺热 | 全草 | 同上 | 5 | 5 |
| 大蓟 | 菊科 | 凉血止血、散瘀消肿 | 全草 | 同上 | 2.5 | 1.25 |
| 黄芪 | 蝶形花科 | 补气、阴虚盗汗 | 根 | 同上 | > 10 | > 10 |
| 蒲公英 | 菊科 | 清热解毒、利尿散结 | 全草 | 同上 | 5 | 5 |
| 金银花 | 忍冬科 | 清热解毒 | 花 | 同上 | 5 | 5 |
| 三角条 | 天南星科 | 除湿健脾、化痰祛瘀 | 根 | 同上 | 2.5 | 2.5 |
| 山茱萸 | 山茱萸科 | 滋阴补肾 | 果实 | 甲醇浸泡7天，滤液回收甲醇蒸干。 | 2.5 | 2.5 |
| 杜仲 | 杜仲科 | 补肾强筋 | 皮 | 同上 | 2.5 | 2.5 |
| 地骨皮 | 茄科 | 滋阴补肾 | 根皮 | 同上 | > 10 | > 10 |
| 川芎 | 伞形科 | 活血化瘀 | 根 | 同上 | > 10 | > 10 |
| 枇杷叶 | 蔷薇科 | 止咳化痰 | 叶 | 同上 | > 10 | > 10 |
| 秦皮 | 木犀科 | 清热燥湿 | 树皮 | 同上 | 2.5 | 2.5 |
| 地丁 | 堇菜科 | 清热解毒 | 全草 | 同上 | > 10 | > 10 |
| 车前草 | 车前科 | 利尿通淋 | 全草 | 同上 | > 10 | > 10 |
| 牛蒡子 | 菊科 | 消肿解毒 | 果实 | 同上 | > 10 | > 10 |
| 辛夷 | 木兰科 | 祛风寒 | 花 | 同上 | > 10 | > 10 |
| 虎杖 | 蓼科 | 利尿除湿、清热解毒 | 根 | 同上 | > 10 | > 10 |
| 苦参 | 豆科 | 清热燥湿 | 根 | 同上 | 2.5 | 2.5 |
| 防风 | 伞形科 | 祛风寒 | 根 | 同上 | > 10 | > 10 |
| 玉竹 | 百合科 | 滋阴 | 根 | 同上 | 2.5 | 2.5 |
| 白芷 | 伞形科 | 清热解毒 | 根 | 同上 | > 10 | > 10 |
| 远志 | 远志科 | 祛痰、安神 | 根 | 同上 | 2.5 | 2.5 |
| 白术 | 菊科 | 燥湿健脾 | 根 | 同上 | 2.5 | 2.5 |
| 半夏 | 天南星科 | 燥湿祛痰 | 根 | 同上 | 2.5 | 2.5 |
| 当归 | 伞形科 | 活血化瘀 | 根 | 同上 | > 10 | > 10 |
| 异烟肼 | - | - | - | - | 1 μg/ml | 1 μg/ml |
表1. 29种中草药名称、传统药效、药用部位、提取方法和抗结核杆菌最小抑菌浓度
| 中草药提取物 | 浓度 (mg/mL) | 提取物 | |
|---|---|---|---|
| +INH (0.5 μg/ml) | +RIF (1.6 μg/ml) | ||
| 大蓟 | 0.6 | + | + |
| 远志 | 1.25 | + | + |
| 千里光 | 1.25 | + | + |
| 三角条 | 1.25 | + | + |
| 山茱萸 | 1.25 | + | − |
| 金银花 | 2.5 | − | − |
| 杜仲 | 1.25 | + | + |
| 秦皮 | 1.25 | + | + |
| 夏枯草 | 2.5 | − | − |
| 玉竹 | 1.25 | + | − |
| 白术 | 1.25 | + | − |
| 半夏 | 1.25 | + | + |
| 苦参 | 1.25 | + | + |
| 蒲公英 | 2.5 | + | + |
表2. 14种中草药与异烟肼、利福平的联合抗BCG试验
郭钧的样本库中。中草药主要通过小分子化合物产生药效，一些小分子因极性小，水煎难以溶出活性分子或溶出有限，我们主要采用乙醇热回流或甲醇浸泡提取，我们推测，造成结果有差异应与提取方法不同有关。
结核分枝杆菌不发酵糖类，与牛分枝杆菌的区别在于结核分枝杆菌可合成烟酸和还原硝酸盐，而牛分枝杆菌不能。牛分枝杆菌BCG菌株对人没有致病性，本试验揭示H37Rv和BCG菌株对中草药的敏感性十分接近，这一点与郭钧的报道相符。因此，对中草药进行抗结核杆菌筛选，可先用BCG菌株初筛，然后再采用H37Rv菌株和野生结核杆菌菌株进行验证。
从中草药中发现与现有抗痨药物不同的分子骨架是研发新型抗结核药物的基础。我们的研究结果表明，三角条具有抗结核杆菌活性，应值得重视。三角条的学名为瑶山南星，是侗族民间医生用于治疗结核的单味秘方，目前未见研究报道。我们拟对三角条进行活性跟踪，相关工作正在进行中。
国家自然科学基金(81460531)，贵州省社会发展科技攻关项目(SY字[
韩立芬,宋善敏,邓伟,甘梦兰,王仁凤,杨再昌. 体外评价29种中药的抗结核分枝杆菌活性In Vitro Evaluation of the Potential Anti Mycoba-Cterium Tuberculosis Activity of 29 Chinese Traditional Medicinal Plants[J]. 药物化学, 2017, 05(03): 39-44. http://dx.doi.org/10.12677/HJMCe.2017.53006