RBMX (也称为hnRNP G)是hnRNP家族的成员,最早被鉴定为表观分子量为43 kDa的核蛋白。本研究目的主要是检验RBMX在ESCC中是否是肿瘤抑制因子的假设。对食管鳞状细胞癌组织进行免疫组织化学和蛋白质印迹分析。采用Kaplan-Meier法来分析ESCC患者的生存率。通过构建RBMX的过表达质粒,研究了RBMX在TE1食管鳞状细胞癌细胞系增殖中的作用。通过CCK-8和流式细胞术测定RBMX对增殖和凋亡的调节。免疫组化分析显示RBMX表达与Ki67呈负相关。生存分析显示RBMX表达与总体生存率显著相关(P < 0.001)。RBMX在TE1细胞中的过表达可导致CyclinD1 (细胞周期蛋白D1)、CDK4和p27水平降低和细胞增殖能力的下降。此外,RBMX的过表达可以诱导TE1细胞凋亡。这些发现表明RBMX参与了食管鳞状细胞癌的增殖,并且RBMX表达水平的升高可能表示食管鳞状细胞癌患者的良好预后。 RBMX (also known as hnRNP G), is a member of hnRNP family and was first identified as a nuclear protein with an apparent molecular weight of 43 kDa. The current study was designed to test the hypothesis that RBMX is a tumor suppressor. Immunohistochemical and western blot analyses were performed in esophageal squamous cell carcinoma tissues. Survival analyses were performed by using the Kaplan-Meier method. The role of RBMX in proliferation was studied in esophageal squamous cell carcinoma cell lines of TE1 by constructing the RBMX overexpression plasmid. The regulation of RBMX on proliferation and apoptosis was determined by Cell Counting Kit-8 assays and Flow Cytometry. Immunohistochemical analysis showed that RBMX expression was negatively associated with Ki67. Survival analysis revealed that RBMX expression was significantly associated with overall survival ( P < 0.001). Over-expression of RBMX in TE1 cells resulted in decreased CyclinD1, CDK4 and p27 levels and the capability for proliferation. In addition, over-expression of RBMX induces the Apoptosis of TE1 cells. These findings suggest that RBMX is involved in the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma, and that elevated levels of RBMX expression may indicate a good prognosis for patients with esophageal squamous cell carcinoma.
RBMX (也称为hnRNP G)是hnRNP家族的成员,最早被鉴定为表观分子量为43 kDa的核蛋白。本研究目的主要是检验RBMX在ESCC中是否是肿瘤抑制因子的假设。对食管鳞状细胞癌组织进行免疫组织化学和蛋白质印迹分析。采用Kaplan-Meier法来分析ESCC患者的生存率。通过构建RBMX的过表达质粒,研究了RBMX在TE1食管鳞状细胞癌细胞系增殖中的作用。通过CCK-8和流式细胞术测定RBMX对增殖和凋亡的调节。免疫组化分析显示RBMX表达与Ki67呈负相关。生存分析显示RBMX表达与总体生存率显著相关(P < 0.001)。RBMX在TE1细胞中的过表达可导致CyclinD1 (细胞周期蛋白D1)、CDK4和p27水平降低和细胞增殖能力的下降。此外,RBMX的过表达可以诱导TE1细胞凋亡。这些发现表明RBMX参与了食管鳞状细胞癌的增殖,并且RBMX表达水平的升高可能表示食管鳞状细胞癌患者的良好预后。
食管鳞状细胞癌,RBMX,细胞增殖,细胞凋亡
—Effects of RBMX on the Proliferation and Apoptosis of Esophageal Squamous Cell Carcinoma
Fang Liu1,2,3, Guicai Li1,2, Zongmei Ding4, Kai Qin5, Songhua Lu5*
1Key Laboratory of Neuroregeneration of Jiangsu and Ministry of Education, Nantong University, Nantong Jiangsu
2Co-Innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University, Nantong Jiangsu
3School of Medicine, Nantong University, Nantong Jiangsu
4Department of Pathology, Northern Jiangsu People’s Hospital; Yangzhou Jiangsu
5Department of Thoracic Surgery, The Affiliated Hai’an Hospital of Nantong University, Hai’an Jiangsu
Received: Jul. 16th, 2021; accepted: Aug. 26th, 2021; published: Sep. 3rd, 2021
RBMX (also known as hnRNP G), is a member of hnRNP family and was first identified as a nuclear protein with an apparent molecular weight of 43 kDa. The current study was designed to test the hypothesis that RBMX is a tumor suppressor. Immunohistochemical and western blot analyses were performed in esophageal squamous cell carcinoma tissues. Survival analyses were performed by using the Kaplan-Meier method. The role of RBMX in proliferation was studied in esophageal squamous cell carcinoma cell lines of TE1 by constructing the RBMX overexpression plasmid. The regulation of RBMX on proliferation and apoptosis was determined by Cell Counting Kit-8 assays and Flow Cytometry. Immunohistochemical analysis showed that RBMX expression was negatively associated with Ki67. Survival analysis revealed that RBMX expression was significantly associated with overall survival (P < 0.001). Over-expression of RBMX in TE1 cells resulted in decreased CyclinD1, CDK4 and p27 levels and the capability for proliferation. In addition, over-expression of RBMX induces the Apoptosis of TE1 cells. These findings suggest that RBMX is involved in the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma, and that elevated levels of RBMX expression may indicate a good prognosis for patients with esophageal squamous cell carcinoma.
Keywords:Esophageal Squamous Cell Carcinoma, RBMX, Cell Proliferation, Cell Apoptosis
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食管癌是世界上第八大常见癌症,也是第六大癌症死亡原因 [
RNA结合蛋白(RBPs)似乎在基因表达调控中起着重要作用,已知其生物学功能是参与mRNA前剪接和转录后调控机制 [
本实验选用食管鳞状细胞癌石蜡标本87例购买自上海芯超生物科技有限公司,为2009.1至2010.12期间手术切除的标本,随访期4.6~6.5年,病理诊断结果确定,有临床相关完整的病理相关资料。蛋白的提取的新鲜食管鳞状细胞癌癌组织与此组织相关癌旁组织标本6例,均由南通大学附属医院提供,体内切除0.5 h内转移入低温冰箱(−80℃)存储。患者的主要临床和病理特征,包括年龄、性别、肿瘤分级、转移、肿瘤大小和浸润情况,见表1。标本根据国际抗癌联盟的TNM分类系统进行分类。患者以男性居多,占60.92%。肿瘤分为“良好”(n = 23)、“中度”(n = 32)或“差”(n = 32)分化。随访时间为5年,范围为1~56个月(中位数 = 37个月)。所有87名患者均获得知情同意。
Parameters | Total | RMBX | P | Ki67 | P | ||
---|---|---|---|---|---|---|---|
Low | High | Low | High | ||||
Age (years) | |||||||
≤65 | 41 | 26 | 15 | 0.822 | 16 | 25 | 0.509 |
>65 | 46 | 31 | 15 | 17 | 29 | ||
Gender | |||||||
Male | 53 | 37 | 16 | 0.357 | 19 | 34 | 0.656 |
Female Histological grade | 34 | 20 | 14 | 14 | 20 | ||
Well | 23 | 6 | 17 | 0.000* | 18 | 5 | 0.000* |
Mod | 32 | 22 | 10 | 11 | 21 | ||
Poor | 32 | 29 | 3 | 4 | 28 | ||
Metastasis | |||||||
Positive | 57 | 23 | 7 | 0.155 | 24 | 33 | 0.354 |
Negative | 30 | 34 | 23 | 9 | 21 | ||
Tumor size (cm) | |||||||
≤5 | 29 | 26 | 3 | 0.004* | 6 | 23 | 0.021* |
>5 | 58 | 31 | 27 | 27 | 31 | ||
Tumor invasion (T) | |||||||
T1 | 15 | 9 | 6 | 0.884 | 6 | 9 | 0.866 |
T2 | 15 | 11 | 4 | 5 | 10 | ||
T3 | 39 | 25 | 14 | 16 | 23 | ||
T4 | 18 | 12 | 6 | 6 | 12 |
表1. 87例ESCC标本临床病理参数,RBMX和KI67之间的表达
NOTE: Statistical analyses were performed by the Pearson χ2 test. *P < 0.05 was considered significant.
人ESCC细胞系TE-1购自中国医学科学院(上海,中国)。细胞在补充有10%胎牛血清的RPMI 1640中于37℃在含有5% CO2的湿化培养箱中培养。
组织或细胞在冷的RIPA缓冲液中裂解(Beyotime Biotechnology, China)。使用布拉德福蛋白质测定试剂盒((Bio-Rad, Hercules, CA, USA)测定蛋白质浓度。将等量的蛋白质加样在10%的SDS-PAGE上。然后将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。然后将膜封闭在5%的无脂牛奶中,随后在4℃下与针对RBMX、PCNA、Cyclin D1、CDK4、p27、p53、Casase-8、Bax、Bcl2和β-actin的一抗一起孵育过夜(Cell Signaling Technology, USA)。用PBST洗涤三次后,将膜与合适的二抗一起孵育。使用增强化学发光试剂检测蛋白质(Beyotime Biotechnology, China)。使用图像软件(ImageJ)测量蛋白质密度。
使用CCK-8 (cell counting Kit-8)测定法测定细胞增殖。简而言之,细胞以2 × 104个细胞/孔的密度接种在96孔板上,并在37℃和5% CO2下培养箱过夜。在指定的时间向每个孔中加入CCK-8试剂(Beyotime Biotechnology),细胞进一步培养4小时。使用微孔板读数器读取490纳米处的吸光度。
将组织切片(1 µm)切割,置于APES预处理的载玻片上,脱蜡,通过分级酒精再水合,并在3%过氧化氢中淬灭。抗原回收通过在10 mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中以高功率(750瓦)微波加热进行,每循环5分钟。冷却至室温下用正常血清封闭2 h后,切片与抗人RBMX及Ki-67兔多克隆抗体(稀释1:150;美国Abcam)。为评估RBMX及Ki-67,随机选择了五个高倍镜视野。每场计数超过500个细胞。通过阳性染色肿瘤细胞的百分比和染色强度来确定两个观察者。RBMX及Ki-67阳性百分比评分如下:0 (5%阳性肿瘤细胞);1 (5%~30%阳性肿瘤细胞);2 (30%~60%阳性肿瘤细胞);3 (>60%阳性肿瘤细胞)。染色强度分级如下:0 (阴性)、1 (弱)、2 (中等)和3 (强)。免疫染色分数计算为阳性分数4染色强度分数的百分比,范围从0分到9分。0分被认为是负数;1~3分被认为是弱表达;4~6分被认为是中等表达;7~9分被认为是强表达。对于统计分析,0~3被视为低表达组,而7~9被视为过表达组。
购自GENECHEM (中国上海)合成的RBMX的过表达质粒,cDNA靶向序列:RBMX,正义链 = 5-GAGGA tccccgggtaccgcgccacca tggcggccgacggc-3和 反义链 = 5-TCACCA tggtggcgaccgggctgacactaactgagcca-3;和阴性对照(NC), 正义链 = 5uucuccgaacguguccgudtdt-3,反义链 = 5-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3。根据制造商的说明,用超高效蛋白进行细胞转染。
通过流式细胞术分析了RBMX对TE1细胞周期的影响。转染的细胞在预冷的PBS中洗涤,并重新悬浮在5 ml 70%乙醇中,然后固定过夜。然后收集乙醇悬浮的细胞,洗涤,用含250毫克核糖核酸酶A的50毫克/毫升碘化丙锭在室温下黑暗中染色30分钟,随后用流式细胞仪和细胞探索软件进行分析。
根据商品说明书,使用PEAnnexin V凋亡检测试剂盒通,过流式细胞仪分析来测量细胞的凋亡(BD Biosciences, CA, USA)。简而言之,用RBMX过度表达或NC转染48小时后收集1 × 105 TE1细胞在室温下以3000转离心5分钟。细胞在冷的PBS中洗涤一次,轻轻重新悬浮在100毫升结合缓冲液中,并在室温下与Annexin V-PE和7AAD在黑暗中孵育15分钟。然后向细胞悬浮液中加入400 ml结合缓冲液,使用流式细胞仪软件进行分析。
通过PASW18统计软件进行统计分析。采用χ2检验分析Ki-67和RBMX表达与临床病理特征的关系。使用Kaplan-Meier方法构建总生存曲线,并使用对数秩检验评估差异的统计学意义,差异显著(P < 0.05)。
为了确定RBMX的表达水平与ESCC之间的相关性,我们使用免疫组织化学染色来检测87例ESCC样本中RBMX和Ki67的表达。免疫组织化学(IHC)结果如图1所示。发现RBMX的免疫反应定位于肿瘤细胞核和胞浆,在高分化ESCC组织中高表达,在低分化ESCC组织中低表达。临床病理参数、RBMX和Ki67表达之间的关系见表1。分析结果表明,RBMX在ESCC的表达与组织学分级(P < 0.001)、肿瘤大小(P = 0.002)和淋巴结转移显著相关,而与年龄、性别和侵袭性无关。此外,在所有ESCC病例中,RBMX的表达与Ki67的表达呈负相关。基于增殖活性发现RBMX表达与ki-67呈负相关(P < 0.01,图2)。
图1. RBMX和KI67在组织切片中的免疫组织化学染色。(A)和(D)显示RBMX和KI67在组织学分级分化良好的组织中的染色。(B)和(E)显示RBMX和KI67在组织学分级中等分化组织中的染色。(C)和(F)显示RBMX在组织学分级低分化组织中的染色(放大400倍)
图2. 在 ESCC中 Ki-67与RBMX的表达关系。ki-67和RBMX的散点图与Spearman相关系数之间的相关性用回归线表示(P < 0.01)
为了验证免疫组织化学结果的特异性,使用蛋白质印迹分析6对新鲜的ESCC组织。以β-actin作为对照,通过光度测定定量RBMX的表达。免疫印迹分析检测RBMX和PCNA的表达,结果与免疫组化一致。在这些情况下,ESCC组织中RBMX的表达水平明显低于邻近的非肿瘤组织(图3)。
图3. 在ESCC组织中RBMX的表达。(A) RBMX在6个有代表性的食管肿瘤组织和邻近非肿瘤组织配对样本中的表达。(B) 条形图通过光度测定定量显示了上述的RBMX蛋白与β-actin的比例。(与邻近非肿瘤组织相比,P < 0.01)
生存分析仅限于87例病例,获得了完整的随访数据和RBMX表达结果。通过使用高水平和低水平的RBMX评估RBMX对ESCC患者的总生存期的预后价值。Kaplan-Meier分析显示,RBMX低表达与总生存期短有相关性(P < 0.01,图4)。使用多变量Cox比例风险模型分析表明,RBMX蛋白可以作为ESCC患者总生存期的一个独立预后指标(P = 0.001,表2)。
图4. 根据RBMX表达的总生存率存活曲线。根据RBMX评分,将患者分为高RBMX表达者(评分 ≥ 4)和低RBMX表达者(评分 < 4)。低表达RBMX组患者的总生存率明显降低
Relative ratio | 95% Confidence interval | P | |
---|---|---|---|
Age (years) | 1.117 | 0.570~1.190 | 0.747 |
Gender | 0.726 | 0.370~1.426 | 0.353 |
Histological grade | 1.711 | 1.005~2915 | 0.048* |
Metastasis | 1.218 | 0.615~2.414 | 0.571 |
Tumor size (cm) | 2.041 | 0.997~4.177 | 0.051 |
Tumor invasion (T) | 1.105 | 0.782~1.563 | 0.547 |
RBMX | 0.260 | 0.116~0.581 | 0001* |
Ki67 | 2.123 | 1.011~4.461 | 0.047* |
表2. Cox回归分析87个样本中各种潜在的影响预后的因素
NOTE: Statistical analyses were performed by the Cox test analysis; *P < 0.05 was considered significant.
为了探索RBMX对ESCC的潜在影响,我们通过转染pcdnagv 144 CMV-EGFP-MCS-SV40-新霉素表达载体增加了RBMX在TE1细胞中的表达。通过蛋白质印迹分析验证了转染子后TE1细胞中RBMX的有效表达(图5(A)和图5(B))。接下来研究RBMX的过表达对ESCC细胞增殖的影响。CCK-8分析显示RBMX过度表达显著降低了TE1细胞的增殖能力(图5(C))。进一步分析RBMX过度表达后对细胞周期相关蛋白的影响,发现RBMX过表达后可下调CyclinD1、CDK4和p27的表达(图5(F))。我们发现,在RBMX过表达的细胞中,G1期的百分比(阴性对照组为51.66%,RBMX过表达组为71.29%)增加,S期百分比(阴性对照组为32.64%,RBMX过表达组为16.53%)降低(图5(D))。此外,G2期细胞百分比降低(阴性对照组为15.70%,RBMX过表达组为12.18%)。这些结果表明RBMX的过度表达可能阻滞细胞周期的G1/S期。
图5. RBMX过度表达降低细胞增殖。(A)和(B)过表达质粒转染TE1细胞48 h后通过蛋白质印迹检测RBMX蛋白表达;(C) CCK-8检测提示RBMX过度表达后TE1细胞增殖较对照组减少;(D)和(E)细胞周期分析显示,在RBMX过表达组中G1期的百分比增加(P < 0.05),而在RBMX过表达细胞中S期(P < 0.05)和G2期(P < 0.05)的百分比与对照细胞相比降低;(F) 细胞周期相关蛋白的蛋白质印迹分析显示Cyclin D1和CDK4和p27在TE1细胞中过度表达后表达降低
由于RBMX蛋白是一种新的p53靶基因产物,它在DNA双链断裂修复的保真度中起重要作用 [
图6. RBMX过表达可诱导TE1细胞凋亡。(A)和(B) 蛋白质印迹分析显示细胞凋亡的相关蛋白,在TE1细胞中过表达RBMX后,p53、Bax和Caspase-8的表达增加,而Bcl-2的表达降低;(C)和(D) RBMX过度表达诱导TE1细胞凋亡(P < 0.05)
研究表明,RBMX的表达在人类口腔癌和口腔鳞状细胞癌中具有肿瘤抑制的活性 [
先前的研究表明RBMX是RBM蛋白的一员,据报道它是一个新的凋亡调节剂家族 [
国家自然科学基金 (31830028, 31771054),江苏省教育厅自然科学重点科研项目(19KJA320006),江苏省卫计委2015年度医改试点单位科研课题(编号:YG2015),扬州市十三五科教强卫重点人才(编号:RCC201857)。
刘 芳,李贵才,丁宗梅,秦 凯,陆松华. RBMX在食管鳞状细胞癌中的相关性研究——RBMX对食管鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响 Study on the Correlation of RBMX in Esophageal Squamous Cell Carcinoma—Effects of RBMX on the Proliferation and Apoptosis of Esophageal Squamous Cell Carcinoma[J]. 生物过程, 2021, 11(03): 54-65. https://doi.org/10.12677/BP.2021.113007
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