微生物对PAHs降解的难易程度取决于化合物的结构复杂性及降解酶的适应性 [ 2 ]。目前的研究表明，微生物对PAHs的降解主要以下面两种方式进行：1) 以低分子量的PAHs (双环或三环)为唯一碳源和能量来源：2) 对于四环及以上的高环PAHs，需要与其他有机质一起进行共代谢即以一种易利用的物质作为微生物生长繁殖的营养物质，同时降解另一种物质，但后一种物质的降解及转化并不会提供共代谢微生物生长所需的能源及碳源。微生物的共代谢作用在难降解污染物PAHs的彻底降解及矿化中起主要作用 [ 3 ] [ 4 ]。

近年来，微生物降解萘、菲等低分子量的PAHs的机理研究较为透彻，但对于高分子PAHs的代谢途径了解还较为有限，主要原因是目前分离出的能高效降解高分子PAHs的菌株较少。微生物降解PAHs的机理研究是探究微生物对PAHs降解能力及代谢产物的基础，也是将其应用于环境修复的必要条件。

萘、蒽和菲等低分子量PAHs广泛存在于整个环境中，并被指定为原型多环芳烃，作为检测多环芳烃污染的标志性化合物。萘代表最简单的多环芳烃，而蒽和菲的结构在许多致癌性PAHs (如苯并[a]芘，苯并[a]蒽)中被发现，而菲代表最小的同时具有湾区和K区的多环芳烃 [ 5 ]。因而菲常被用作研究致癌PAHs的模型底物。以下将重点介绍菲的降解机理。

目前的研究表明，菲的降解主要存在以下两种：即以代谢中间产物命名的水杨酸途径和邻苯二甲酸途径。在有氧条件下，细菌通常通过双加氧酶攻击菲的苯环，不同降解菌攻击位置有所不同。以伯克霍尔德菌属为例，其对菲的苯环攻击方式有两种方式：一是利用双加氧酶攻击C-1和C-2，生成顺式-1,2-二羟基菲；第二种是攻击C-3和C-4，生成顺式-3,4-二羟基菲 [ 6 ]。此外，节杆菌属P1-1菌株可通过在1,2-，3,4-和9,10-C位置双氧化而降解菲，中间产物菲-1,2-，3,4-和9,10-二醇主要发生间位裂解并转化为萘-1,2-二醇 [ 7 ]。

多环芳烃最终能否被彻底降解，与苯环能否被彻底裂解有关。各个菲降解菌属以不同的代谢中间产物进入三羧酸循环，主要是由于其中间代谢途径的不同。绝大部分菌株的代谢产物是以水杨酸和邻苯二酚的形式进入三羧酸循环的。而能够降解菲，但是无法利用萘为唯一碳源和能源进行生长的菌株则是通过邻苯二甲酸和原儿茶酸途径最终进入三羧酸循环 [ 8 ]。此外，邻苯二酚又在邻苯二酚-1，2-双加氧酶和邻苯二酚-3，4-双加氧酶的作用下，形成间位和邻位两种结构从而又分支为两种代谢途径 [ 9 ]。由此可见菲的降解途径较为复杂。

1) 主要试剂

菲(Phenanthrene) ≥ 97% (美国CNW)；芘(Pyrene) ≥ 97% (美国CNW)；萘(Naphthalene) ≥ 99.5% (国药集团化学试剂有限公司)；色谱级乙酸乙酯；色谱级正己烷。配制1mol/L的NaOH溶液和0.1 mol/L的盐酸溶液用于调节pH。

2) 培养基

① MSM培养基：NaNO 34.0 g、NH₄Cl₂ 2.0 g、KH₂PO 41.5 g、Na₂HPO 40.5 g、CaCl₂ 0.01 g、MgCl₂ 0.2 g、1 mL微量元素溶液、去离子水1 L，调至pH = 7.0，121℃灭菌20 min。

② 选择培养基(固体培养基)：NaNO 34.0 g、KH₂PO 41.5 g、Na₂HPO 40.5 g、CaCl₂ 0.01 g、MgCl₂ 0.2 g、琼脂20.0 g、微量元素溶液1 mL、去离子水1 L，pH = 7.0，121℃灭菌20 min。

③ 富集培养基：蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、NaCl 10.0 g，溶入1 L去离子水中，用NaOH及HCl调至pH = 7.0，121℃灭菌20 min。

④ 菌种保藏培养基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂20.0 g、去离子水1 L，调至pH = 7.0，121℃灭菌20 min。

3) 种子液制备

取保存的斜面培养基于室温条件下放置2 h，使用无菌滴管吸取0.5 mL无机盐培养基滴入到斜面上，轻微震荡后，取0.2 ml菌悬液于固体培养基上划线分离培养96 h。从固体培养基上挑取生长状况良好的菌株，接种到添加菲的无菌无机盐培养基中，其中菲的浓度为100 mg/L，在30℃，180 rpm条件下作为接种种子液。为保证试验结果的一致性，接种菌液均通过无机盐培养基调节到相同OD600值进行接种。

本试验通过测量在600 nm下的细菌培养物的光密度(OD600)来监测细胞生长量，并以去离子水进行矫正。为了校正由溶解的细胞外的物质产生的吸光度，将样品通过0.22 μm的PTFE过滤器过滤以除去细胞，并将滤液的600 nm处的吸光度从未过滤样品中扣除。使用实验校准曲线将获得的值转换成每克细胞干重克数(生物量浓度(g/L) = 0.5415*吸光度)。

使用移液器吸取1 mL菌液注入2 mL离心管中，并加入1 mL乙酸乙酯，将离心管置于涡旋混匀器上，震荡20 min，使其混匀完全，接着以5000 r/min离心10 min。吸取上层有机相，向离心管中再次加入1 mL乙酸乙酯，重复混匀、离心，将两次有机相合并于一个新的离心管中，定容至2 mL。使用一次性注射器抽取，过0.22 μm有机系滤膜注入GC-MS进样瓶，保存于4℃冰箱中，待上机测定。

pH对于有机物的降解具有显著地影响。一方面，pH会影响微生物的生长；另一方面，与有机物降解相关的酶的活性及环境中的离子强度及电子传递也与pH有较大关系。本部分试验利用1 mol/L的NaOH溶液和0.1 mol/L的盐酸溶液将灭菌的无机盐培养基的初始pH分别调节到5、6、7、8、9五个梯度，研究不同pH条件下，菌株Lphe-2的生长状况及其对菲降解效果的影响。各试验组菲的浓度均为100 mg/L，装液量均为100 mL/250 mL，接种量5% (OD600 = 0.6)，每组设置3个平行，放置于30℃，180 rpm的恒温震荡箱中培养5d后，取样测定其OD600，萃取后测定其中菲的浓度，并计算其降解率。

温度对于有机物的降解具有至关重要的影响，各种细菌的降解酶都有自己的最适温度范围。本部分试验通过调节恒温震荡箱的温度分别为15℃、25℃、30℃、35℃、45℃五个梯度，研究温度对于菌株Lphe-2生长状况及降解效果的影响。各试验组菲的浓度均为100 mg/L，装液量均为100 mL/250 mL，初始pH均为7.0，接种量5% (OD600 = 0.6)，每组设置3个平行，摇床转速均为180 rpm，培养5 d后，取样测定其OD600，萃取后测定其中菲的浓度，并计算其降解量。

接种量是指种子液体积占接种后培养基总体积的比例。接种量的大小与菌株在培养基中的生长速度密切相关，接种量较大时有助于缩短菌株在培养基中的适应延滞期，使其迅速成为优势菌种并降低其感染杂菌的几率。本部分试验通过调节接种量分别为1%、2%、5%、10%、15%五个梯度，种子液OD600 = 0.6，研究接种量对于菌株Lphe-2生长及降解效果的影响。各试验组菲的浓度均为100 mg/L，装液量均为100 mL/250 mL，初始pH均为7.0，每组设置3个平行，放置于30℃，180 rpm的恒温震荡箱中培养5 d后，取样测定其OD600，萃取后测定其中菲的浓度，并计算其降解量。

一些高分子量的PAHs很难直接被微生物以唯一碳源的方式降解，需要以共代谢方式降解。通过添加葡萄糖、乙酸钠、苯酚、丙酮酸钠四种小分子碳源，浓度均为200 mg/L，研究添加不同共代谢物对于菌株Lphe-2的生长及降解效果的影响，以不加其他碳源的一组作为对照组。各组中菲的浓度为100 mg/L，装液量为100 mL/250 mL，初始pH7.0，接种量5% (OD600 = 0.6)，每组设置3个平行，放置于30℃，180 rpm的恒温震荡箱中培养5 d后，取样测定其OD600，萃取后测定其中菲的浓度，并计算其降解量。

共代谢物的种类及浓度都会对PAHs降解菌的生长及降解产生影响。本部分试验在1.7确定最佳共代谢物种类的基础上进一步研究其共代谢物的最佳添加浓度。设置浓度梯度为200 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L、1500 mg/L及2000 mg/L，以不添加共代谢物的为空白对照。各组中菲的浓度为100 mg/L，装液量为100 mL/250 mL，初始pH = 7.0，接种量5% (OD600 = 0.6)，每组设置3个平行，放置于30℃，180 rpm的恒温震荡箱中培养5 d后，取样测定其OD600，萃取后测定其中菲的浓度，并计算其降解量。

在上述各影响因素的最佳水平确定后，将菌株Lphe-2的各环境参数均调到最佳条件，即在最适pH、最适温度、最佳接种量、最佳共代谢物及最佳浓度的条件下，培养菌株Lphe-2。设置3个平行，放置于180 rpm的恒温震荡箱中培养，从接种的第0 d起，每天在固定时间取样测定OD600及菌液中剩余菲的浓度。连续测定若干天，以培养时间为自变量，细菌生物量及菲的降解率为因变量，将结果绘制成菌株的生长曲线及降解曲线。

由于微生物生物量有时被用作研究污染物生物降解动力学的工具，所以建模模拟其生长参数可以对生物修复过程有更好的了解。由于本试验底物菲对于细菌具有毒害作用，因此选用细胞生长底物抑制模型对菌株Lphe-2降解过程中的生长进行模拟。Haldane模型是一种在Monod模型上进行改进的底物抑制模型。方程式如下所示：

μ = μ max ⋅ S K S + S ⋅ ( 1 + S K i ) (1)

X = X 0 e μ t (2)

其中，μ——比增长速率(h⁻¹)；μ_max——最大比增长速率(h⁻¹)；S——底物浓度(mg/L)；K_s——半饱和系数；K_i——底物抑制常数；X——细菌浓度(mg/L)；X₀——细菌初始浓度(mg/L)。

众所周知，自然环境中多环芳烃通常以多组分混合物的形式存在，因而研究底物相互作用在生物降解中的作用对于理解PAHs的命运具有重要意义。本部分试验以三种多环芳烃混合物作为底物，即萘(nap)，菲(phe)，芘(pyr)，浓度均为30 mg/L，接种菌株Lphe-2，研究其降解特性。以未添加菌株Lphe-2的作为对照组。每组设置3组平行，每天相同时间取样，连续取样7 d测定其中PAHs的浓度并计算其降解率。

培养基初始pH设置为5、6、7、8、9五个梯度，在30℃，180 rpm的恒温震荡培养箱中培养菌株Lphe-25d后，取样测定其中Phe的浓度及菌株生长情况，结果如图1所示。

由图1可知，当培养基的初始pH值在5-7范围时，菌株Lphe-2的生物量较大，且初始pH为6左右时，生物量最大。当初始pH大于7时，菌株生长量会有较大幅度的降低。由此可以推断，菌株Lphe-2适宜在弱酸性的环境下生长，且最适合生长的pH值为6。同样，当培养基的初始pH值在5~7范围时，菌株Lphe-2对菲的降解量也较高，且pH为6左右时，菌株Lphe-2对菲的降解量最高，可达到68.19 mg/L。当初始pH不在此范围内时，菌株对菲的降解效果会有所下降。pH值从8~9时，菌株Lphe-2对菲的降解量均小于15 mg/L，说明此范围内的初始pH，菌株对菲的降解能力较差。说明菌株Lphe-2不适用于碱性环境生长，但在弱酸性环境中具有较高的降解率。最终，确定菌株Lphe-2降解菲的最适pH值为6。

另外，从图1也可以看出，菌株Lphe-2的生长量及对菲的降解量随初始pH值的变化呈现大体一致的趋势，这就说明培养基中的初始pH值对菌株Lphe-2的生长情况及对菲降解能力的影响大体上是相同的。

文献资料显示 [ 10 ] [ 11 ] ，一些耐酸革兰氏阳性菌，如分支杆菌属，芽孢杆菌属及酿酒酵母菌，在酸性条件下均显示出对PAHs更好的降解效果，原因在于低的pH可以诱导细菌对于疏水性有机物产生更好的渗透性，从而增加其生物利用度。

图1. pH对菌株Lphe-2的生长及phe降解能力的影响

考察培养温度对菌株Lphe-2生长及降解的影响，设置温度分别为15℃、25℃、30℃、35℃、45℃五个梯度。在恒温震荡培养箱中以180 rpm，培养5 d后取样测定其中Phe的浓度及菌株生长情况，结果如图2所示。

图2. 温度对菌株Lphe-2的生长及phe降解能力的影响

分析图2可知，菌株较为适宜生长的温度在30℃~35℃附近，在此温度范围内，菌株生长量较大，且降解效果较好。当温度低于25℃或高于35℃时，菌株生长量较低，说明菌株Lphe-2是嗜中温微生物。观察到一个异常情况，即温度为45℃时，phe浓度减少最多，而此条件下的菌株生长量并不大，明显低于温度为30℃的情况，考虑到phe的半挥发性，故推测此时phe的减少并非单纯由于微生物的降解作用，主要是由于高温下的挥发作用导致的。综合考虑菌株生长量及降解效果，确定菌株Lphe-2的最佳培养温度为30℃，此时菌株生长量也最大。此时，降解量可达50.1 mg/L。一般而言，当培养温度升高时，PAHs的溶解度也增加。反过来会增加其生物利用度；另一方面，随着温度的升高，液体培养基中的溶解氧水平降低，对于好氧型嗜温微生物而言，会导致其代谢活性降低，同样不利于污染物的微生物降解。对于菌株Lphe-2而言，温度在30℃~35℃范围内，对phe的5 d降解量均可达45 mg/L以上，这对于实际PAHs污染场地的修复具有重要意义。

设置接种量分别为1%、2%、5%、10%和15%五个梯度，考察接种量对菌株Lphe-2生长及降解效果的影响，在恒温震荡培养箱中以180 rpm，30℃条件培养5 d后，取样测定其中phe的浓度及菌株生长情况，结果如图3所示。

分析图3可知，接种量为10%时菌株的降解量最大，为56.52 mg/L。接种量从2%到10%菌株的生长状况都较好，OD600均大于0.55。但接种量为1%时，降解量显然较低，原因可能是较低的接种量导致单位phe被降解的时间较长。而随着接种量增加，菌种浓度也随之增加，在接种量达到15%时，降解量不增反降，可能是由于细胞过量生长导致营养匮乏，或是高的初始菌株接种量导致生成物中某些有害物质积累速度过快，提前抑制了底物的进一步降解。因此最佳接种量确定为10%。

图3. 接种量对菌株Lphe-2生长及phe降解能力的影响

以葡萄糖、乙酸钠、苯酚、丙酮酸钠为辅助碳源，进行菌株Lphe-2共代谢试验，考察共代谢作用对菌株Lphe-2生长及降解效果的影响。结果如图4所示。

分析图4可知，与不添加共代谢物的对照组相比，添加葡萄糖和乙酸钠的两组，菌株生物量均有所增加，但降解量却偏低，说明这两种小分子碳源能为菌株Lphe-2提供生长能量来源，但同时也与phe形成碳源竞争关系，细菌倾向于利用分子量小、结构简单的碳源，导致对phe的降解效果变差。添加苯酚和丙酮酸钠作为共代谢物时，降解量高于空白对照组。原因可能是苯酚能够诱导开环的酶，这些开环酶同时可以用于对于phe的开环降解；而丙酮酸钠已经被证明 [ 12 ] 是一种可以添加到PAHs污染土壤中的碳源候选物，可以刺激土壤中PAHs降解微生物的生长。本试验结果与其相符。菌株Lphe-2降解phe的最佳共代谢物为丙酮酸钠，降解量可达到77.79 mg/L。

图4. 共代谢对菌株Lphe-2生长及phe降解能力的影响

前文已经确定菌株Lphe-2降解phe的最佳共代谢物为丙酮酸钠，本部分试验进一步确定丙酮酸钠添加浓度对于菌株生长状况及降解效果的影响。设置丙酮酸钠的添加浓度分别为200 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L、1500 mg/L、2000 mg/L。试验结果如图5所示。

图5. 添加不同浓度丙酮酸钠对菌株Lphe-2生长及降解能力的影响

由图5可知，当丙酮酸钠添加浓度为0~2000 mg/L，菌株Lphe-2的生长量均在0.3左右，说明丙酮酸钠添加量对菌株生长没有明显影响，但对于phe的降解情况而言，添加浓度为1000 mg/L时，降解效果最好，为57.3 mg/L。而低于或高于1000 mg/L时，菌株对phe的降解量均偏低。原因为添加少于最佳量的共代谢物质会导致生物降解缓慢，而由于生物量的过度增加，超过最佳量的共代谢物质可能会阻碍细菌与phe的接触，从而导致生物修复的停止。

本部分试验以三种多环芳烃混合物作为底物，即萘(nap)，菲(phe)，芘(pyr)，浓度均为30 mg/L，接种菌株Lphe-2，研究其降解特性。以未添加菌株Lphe-2的一组作为对照组。试验结果如图9所示。

分析结果可知，未接种菌株的空白对照组中，phe和pyr的浓度基本稳定不变，而nap的浓度在前2 d变化不大，后面迅速下降。分析原因为nap是易挥发性物质，而phe和pyr是半挥发性物质。对比接菌组和空白组，可以发现接种菌株Lphe-2对phe和pyr具有显著的降解效果，phe的降解率达93.53%，pyr的降解率达47.16%。然而对于nap而言，虽然未接菌情况下也会挥发减少，但最终浓度还维持在9 mg/L左右，而接菌后1 d即迅速降解到2.34 mg/L，且4 d后几乎降解完全。可见菌株Lphe-2在多种PAHs降解具有广谱性，因此菌株Lphe-2在实际土壤修复工程中具有很好的应用前景。

图9. 菌株Lphe-2对多种PAHs的广谱性试验