以中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php)为主，中国知网(CNKI, https://www.cnki.net/)为辅，以菟丝子、玉蝴蝶、柿叶为关键词，收集玉蝴蝶祛斑膏全方3味中药化合物。以DL ≥ 0.18作为筛选条件，得到玉蝴蝶祛斑膏的潜在有效活性化合物。

通过Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)分别查找玉蝴蝶祛斑膏中柿叶、木蝴蝶和菟丝子潜在有效活性化合物的SMILE号，去重后利用Swiss Target Prediction数据库 (http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)进行潜在有效活性靶点蛋白的预测，将三个药味所含潜在有效活性化合物所预测的潜在有效活性靶点蛋白合并、去重，采用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)标准化所得潜在有效活性靶点蛋白，这些靶点蛋白即为玉蝴蝶祛斑膏的关键靶点蛋白，标准化后得到靶点蛋白的基因名称和UniProt编号。采用Cytoscape 3.9.1软件构建玉蝴蝶祛斑膏潜在有效化合物及潜在有效靶点蛋白网络，并对其进行网络拓扑结构分析和可视化分析。

以“chloasma”、“melanosis”、“chloasmas”等为关键词，在DisGeNET (https://www.disgenet.org/)、GeneCards (https://www.genecards.org/)、TTD (Therapeutic Target Database, http://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM (https://www.omim.org/)、PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/)、Drugbank数据库(https://www.drugbank.ca/)中进行检索。合并以上数据库所获得黄褐斑疾病靶点蛋数据，去重，最后将黄褐斑疾病靶点蛋白名称输入UniProt数据库中以获取基因名称和UniPro编号。

利用微生信平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)绘制玉蝴蝶祛斑膏潜在有效活性成分靶点蛋白和黄褐斑疾病靶点蛋白韦恩图，韦恩图中交集的共同靶点蛋白可能是玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑疾病的关键靶点。通过STRING数据库(https://cn.string-db.org/)构建靶点蛋白–靶点蛋白相互作用(Protein-Protein Interaction, PPI)网络模型，将PPI网络分析结果导入Cytoscape 3.9.1软件进行拓扑学分析并可视化PPI网络。

通过DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，对所获得玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑疾病的关键靶点蛋白进行GO基因本体论分析，其分析包括三部分构成，分为生物过程板块、分子功能板块以及细胞组成板块，限定P < 0.01且FDR < 0.05的筛选结果，对生物过程P值前20的结果采用微生信平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)以三合一双侧条形图的形式进行可视化展现；通过KEGG富集分析，对所获得玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑疾病的关键靶点进行通路分析，限定P < 0.01且FDR < 0.01的筛选结果，使用微生信平台以气泡图的形式进行可视化呈现富集结果。

通过TCMSP数据库及CNKI平台的收集与筛选，以菟丝子、木蝴蝶、柿叶为关键词，收集玉蝴蝶祛斑膏全方3味中药所含潜在有效活性化学成分。以DL ≥ 0.18作为筛选条件对所收集到的潜在有效活性化合物进行筛选，得到柿叶潜在有效活性成分11个，木蝴蝶潜在有效活性成分46个，菟丝子潜在有效活性成分16个。合并去重后共得到66个潜在有效活性成分，具体信息见表1。

这提示着玉蝴蝶祛斑膏具有多成分的治疗特点。

表1. 玉蝴蝶祛斑膏有效活性成分

将上述三个化合物的66个潜在有效活性化合物，通过Swiss Target Prediction数据库，查找233个人类潜在有效活性靶点蛋白存在于柿叶中，373个人类潜在有效活性靶点蛋白存在于木蝴蝶中，294个人类潜在有效活性靶点蛋白存在于菟丝子中。其中有8个潜在有效活性化合物未能找到相关潜在有效活性靶点蛋白，合并，去重得到478个潜在有效活性靶点蛋白，其化合物–靶点蛋白网络，详细信息见图1。

图1. 玉蝴蝶祛斑膏“化合物–靶点蛋白”网络

该“化合物–靶点蛋白”网络图共536个节点(其中包括58个潜在有效化合物节点和478个潜在有效靶点蛋白节点)和3655条边组成，在所获得的玉蝴蝶祛斑膏的66个潜在有效化合物中，现有数据仅找出58个潜在有效化合物有相对应的潜在有效靶点蛋白，有8个潜在有效化合物未找到相对应的潜在有效靶点蛋白，故玉蝴蝶祛斑膏的“化合物–靶点蛋白”图中只显示58个潜在有效化合物节点和478个潜在有效靶点蛋白节点。经过网络拓扑结构分析，左侧圆节点为三个药味所包含的潜在有效活性化合物，右侧圆节点为潜在有效活性化合物所对应的靶点蛋白，潜在有效化合物的平均度值为63.02，其中高于该平均度值的潜在有效化合物有23个。其中，来自于柿叶、木蝴蝶与菟丝子的共有成分槲皮素(Quercetin)的节点度最高，度值为312，降序依次为来自柿叶、菟丝子中的山柰酚(Kaempferol)，度值为208，柿叶、木蝴蝶与菟丝子中的β-谷甾醇(Beta-sitosterol)，度值为132，潜在有效靶点蛋白的平均度值为7.65，有183个潜在有效靶点蛋白的度值高于该平均度值，其中节点度最高的为芳香化酶A1 (Cytochrome P450 19A1, CYP19A1)，靶向44个潜在有效活性化合物，降序依次为细胞周期蛋白依赖性激酶1 (Cyclin-Dependent Kinase 1, CDK1)，靶向39个潜在有效活性化合物，乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)，靶向38个化合物，表2仅列出度值最高的前20项潜在有效活性化合物和潜在有效活性靶点蛋白。该数据有效表明了玉蝴蝶祛斑膏具有多成分、多靶点的网络药理学分析的特性。

表2. 玉蝴蝶祛斑膏“化合物–靶点蛋白”网络拓扑学参数

通过数据库检索，GeneCards检索到黄褐斑相关靶点954个、PHarmGKB数据库检索到黄褐斑相关靶点201个、DisGeNET检索到黄褐斑相关靶点48个、OMIM检索到黄褐斑相关靶点10个、Drugbank检索到黄褐斑相关靶点4个、TTD检索到黄褐斑相关靶点3个。合并所获得的黄褐斑疾病靶点蛋白，去重，得到黄褐斑疾病靶点基因1084个。将玉蝴蝶祛斑膏化合物的478个靶点与黄褐斑疾病靶点的2084个靶点导入Venny 2.1软件得到玉蝴蝶祛斑膏化合物与黄褐斑疾病的120个共同靶点，即视为玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑的关键靶点，见图2。

图2. 玉蝴蝶祛斑膏化合物靶点–黄褐斑靶点韦恩图

将120个关键靶点导入STRING数据库中，结果进一步导入Cytoscape 3.9.1软件进行拓扑学分析并构建PPI网络，见图3。

图3. 关键靶点PPI网络

该PPI网络图包含120个节点和1414条边。节点颜色的深浅表示度值大小，其节点颜色越深，其所对应节点度值越大，反之越小；节点大小表示度值大小，其节点越大，其所对应节点度值越大，反之越小；经过网络拓扑学结构分析和优化，关键靶点蛋白的节点平均自由度为23.57，平均介数为0.0082，平均接近中心性为0.52以及平均最短路径长度的均值为1.97。其中有21个关键靶点蛋白的节点自由度、介数以及接近中心性数均高于均值，并且这21个关键靶点蛋白的节点平均最短路径长度低于均值，表3仅列出度值最高的前20项关键靶点蛋白数据，提示着这些关键靶点蛋白可能在黄褐斑疾病的治疗中起到关键性作用。

表3. 玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑的关键靶点拓扑学参数

将120个关键靶点蛋白通过DAVID数据库的GO本体论分析，共得到328个富集条目(P < 0.01, FDR < 0.05)，其中BP获得225个条目，主要涉及激素应答、细胞对有机物的反应、氧化反应、规律性细胞死亡的正调控、蛋白酶正向调节、细胞增殖的调控、调节蛋白质磷酸化和炎症反应等；CC获得40个条目，主要涉及膜筏、膜侧、色素粒、细胞基质、胞外区、细胞质和线粒体等；MF获得63个条目，主要涉及氧化还原酶活性、RNA聚合酶II转录因子活性、转录酶活性、ATP结合和NADP结合等。分别选取BP、CC和MF根据P值最小前20的条目，见图4。该富集结果提示着玉蝴蝶祛斑膏在治疗黄褐斑过程中通过参与调控多种生物学过程而发挥作用。

图4. 关键靶点的GO条目

通过分析发现，120个靶点集中显著富集在131条通路上(P < 0.01, FDR < 0.01)，选取P值排名最小的前20条富集通路，见表4、图5，主要涉及癌症通路(Pathways in cancer)、癌症蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、内分泌信号通路(Endocrine resistance)等。这提示着玉蝴蝶祛斑膏可能通过作用于多条通路来发挥治疗黄褐斑疾病的作用。

表4. 玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑关键靶点的通路表

图5. 通路富集分析气泡图

玉蝴蝶祛斑膏由柿叶、木蝴蝶和菟丝子组方而成，具有养颜、护肤、祛斑的功效。本研究以TCMSP数据库为基础，分别以柿叶、木蝴蝶及菟丝子等关键词收集到的化学成分在一定程度上可以代表玉蝴蝶祛斑膏全方所含的化学成分。通过“药物成分–靶点”网络拓扑学分析，汇总玉蝴蝶祛斑膏潜在活性成分66个，其中自由度较高的化学成分有槲皮素、山奈酚、白杨素、黄芩素、金丝桃苷和野黄芩素等。有研究表明，黄酮类化合物具有很好的抗氧化活性 [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] ，其槲皮素、山奈酚在体外具有显著的抗氧化活性，在一定条件下可作为抗氧化剂的使用 [ 15 ] [ 16 ] ，有学者通过LPS诱导的小鼠巨噬细胞释放NO、TNF-α、IL-6等炎症因子，研究黄芩素对DPPH和超氧阴离子的清除作用，实验结果表明，黄芩素主要通过清除过量的DPPH自由基和超氧阴离子而发挥抗氧化的作用 [ 17 ] 。研究表明，金丝桃苷能显著抑制自由基脂质过氧化，增强机体抗氧化能力，加速机体对自由基的清除作用 [ 18 ] 。

网络拓扑分析结果显示，玉蝴蝶祛斑膏的潜在成分对应478个靶点，其中与黄褐斑疾病靶点相关的共同靶点有120个，通过构建PPI网络发现，TNF、AKT1、SRC、EGFR、MAPK3等的度值较大，可能是玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑的关键靶点。TNF可诱导多种细胞内信号并具有细胞增殖、代谢等多种生物活性，通过降低TNF-α的炎性级联反应，能够抑制皮肤表皮黑色素细胞的活性，并且能够有效降低黑素瘤细胞的络氨酸酶的活性，以达到显著减少黑色素的合成，在治疗黄褐斑等皮肤疾病上有显著的优势 [ 19 ] [ 20 ] 。AKT1可调节细胞增殖、代谢等生物过程，过程中PI3K和AKT信号通路能够被许多细胞刺激而激活，并促进自由基的表达，发挥抗氧化作用 [ 21 ] 。

通过GO功能富集分析可知，玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑的生物进程主要涉及激素应答、细胞对有机物的反应、氧化反应、规律性细胞死亡的正调控、蛋白酶正向调节、细胞增殖的调控、调节蛋白质磷酸化和炎症反应等。通过KEGG功能富集分析可知，玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑的生物学进程主要以T细胞、B细胞以及巨噬细胞为代表的免疫细胞为主导，涉及白介素-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、TNF肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、破骨细胞分化(Osteoclast differentiation)、自然杀伤细胞介导的细胞毒性(Natural killer cell mediated cytotoxicity)、TRP通道炎性介质调节(Inflammatory mediator regulation of TRP channels)等。黄褐斑的发病机理复杂、多样，单一靶点的药物难以取得较好的疗效，因此寻找一种多成分、多靶点的药物已成为未来治疗黄褐斑的一大优势。