1. 引言

奶牛乳房炎是世界范围内奶牛生产中最常见、危害最大的一种疾病 [1] - [19] ，在奶牛疾病中位居首位 [20] ，给奶牛业造成了巨大的损失。乳房炎是由病原菌侵入乳腺而引起的一种炎症反应 [21] 。目前国内已积累了大量关于奶牛乳房炎病原菌分离培养及鉴定等研究资料 [1] - [18] ，但存在病原菌种属划分模糊、研究时空尺度和技术分析手段等不统一问题，缺乏病原菌时空分布及畜间和菌群间动态变化等疾病流行和预防相关的环境背景资料。集约化和规模化养殖推广后，奶牛乳房炎发病率呈直线上升趋势 [22] 。为此，本文基于我国7个地理分区中代表性的18个省市区1998~2014年报道的文献资料 [1] - [18] ，从群落生态学角度比较不同地区奶牛乳房炎病原菌群落的分布特征，以期为今后奶牛乳房炎的流行病学调查重点和早期防控提供研究思路和导向。

2. 研究对象与方法

2.1. 研究对象

中国不同地区可培养的奶牛乳房炎病原菌。

2.2. 研究方法

基于中文期刊数据库的文献计量学方法，通过“百度学术”搜索1998~2014年关键词“奶牛乳房炎”和“病原菌”，共获得1270篇文献。继续搜索筛选出具有“XX区域”标识的文章标题以及全文中具有“菌株”及其“检出率”的数据信息，共筛选出关于18个省市区的文献资料18篇 [1] - [18] 。最后，将18个省市区奶牛乳房病原菌相关资料依据我国行政区划进行归类，共得到7个地理分区。

将上述文献报道的中国7个地理分区18个省市区几十个规模化养牛场或养殖户作为研究区域，基于传统分离培养法 [1] - [18] 及形态学和生理生化鉴定 [1] - [18] 获得的奶牛乳房炎病原菌为研究对象(表1)。对

临床型乳房炎：患乳房炎(体细胞数量升高)的奶牛表现出乳房肿胀或化脓、牛奶稀薄或变色并出现絮状物或血丝、甚至全身症状等临床症状；隐性乳房炎：患乳房炎(体细胞数量升高)的奶牛没有上述临床症状。

有明确种属及其检出率的病原菌进行统计分类、无明确种属名称(其他微生物、霉菌、杂菌、革兰氏阳性或阴性杆菌)或未统计检出率的所有奶牛乳房炎病原菌归为其他微生物类群。

用Excel 2007软件统计各地奶牛乳房炎病原菌群落组成及其检出率，并进行基本图形绘制。用R语言(http://www.r-project.org)中gplots软件包绘制heatmap图以进行奶牛乳房炎病原菌种群间和地区群落间二维等级聚类分析以反映种群间及群落间差异性或相似性。具体步骤如下：选择数据包>library(gplots)→选择数据>x<-read.table(f:/mastitis.txt,head=T)→选择并运行程序>heatmap.2(as.matrix(x[1:25,]), col = redgreen(75), cexCol = 0.9, key = T, symkey = F, density.info = none, trace = none)→输出图形→保存图形为需要的格式。注意，R语言使用过程中必须使用英文字符及名称，不区分大小写。其中“f:”和“mastitis”为可变参数，可依据个人喜好进行选择和命名；其他参数均可选择固定的默认格式。“f:”为盘符，“mastitis”为文件名。

3. 结果与分析

3.1. 不同地区奶牛乳房炎病原菌群落组成及分布情况

18个省市区共获得30个已知种属及其检出率的病原菌种群和1个无明确种属名称或未统计检出率的其他微生物类群(见1.1)。例如，北京报道的其他菌6.9% [1] 和广西南宁报道的其他杆菌6.2% [13] 均视为1个类群。上海报道的 ① 霉菌6.2%和 ② 杂菌5.1% [16] 、广东深圳报道的 ① 霉菌2%和 ② 其他革兰氏阴性杆菌2%等 [12] 、河南郑州报道的其他杂菌1.6% [10] 、贵州贵阳报道的 ① 革兰氏阴性杆菌4.2%和 ② 其他革兰氏阳性杆菌3.5% [18] 均视为其他微生物类群。辽宁沈阳报道的乳房链球菌、肺炎克雷伯菌、化脓链球菌、表皮葡萄球菌、其他革兰氏阳性杆菌、志贺菌属、木糖葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、产酸克雷伯氏菌、腐生葡萄球菌、牛棒状杆菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、粪链球菌、产气芽胞梭菌、变形杆菌属等16类病原菌 [8] 由于没有单独计算病原菌种属的检出率，故将其合并为其他微生物类群，累积检出率为52.7%。另外进行图形绘制时，将黑龙江哈尔滨特有的柠檬酸盐杆菌4.3% [9] 、新疆石河子特有的奇形变异菌2.9% [7] 、广东深圳特有的爱德华氏菌1%、肠杆菌1%、蜡状芽胞杆菌1%、星状奴卡氏菌1% [12] 归入其他微生物类群，见图1和1.1部分。

来自7个地理分区的18个省市区奶牛乳房炎病原菌的群落组成及检出率差异明显，表现为种群数量(表1)、优势及罕见种群差异(图1)。例如，辽宁沈阳包括15.4%的金黄色葡萄球菌、12.2%的无乳链球菌、最优势的大肠杆菌19.7%和1个累计检出率高达52.7%的其他微生物类群；甘肃兰州包括检出率高达61.5%的最优势金黄色葡萄球菌、15.4%的大肠杆菌和无乳链球菌种群、3.8%的乳房链球菌和停乳链球菌。

3.1.1. 优势细菌种群的地区分布特征

金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌、表皮葡萄球菌是奶牛乳房炎的优势病原菌。6种优势病原菌检出率的累积值为47.3%~100.0%。其中，重庆、甘肃兰州、陕西渭南和安徽等地区为100.0%，江苏徐州97.7%，内蒙古呼和浩特96.7%，河北衡水95.1%，湖北91.6%，河南郑州82.3%，黑龙江哈尔滨78.7%，北京78.2%，贵州贵阳78.1%，广东深圳72.9%，四川成都72.3%，广西南宁66.0%，新疆石河子65.2%，上海58.8%，辽宁沈阳47.3%。不同地区最优势种群不同，金黄色葡萄球菌是甘肃兰州61.5%、重庆42.8%、河北衡水35.8%、陕西渭南37.5%、安徽34.7%、黑龙江哈尔滨19.6%、四川成都22.2%、北京25.4%和贵州贵阳33.5%等9地区最优势的种群；无乳链球菌是广东深圳23.5%、内蒙古呼和浩特29.0%、河南郑州24.2%等3地区最优势的种群；大肠杆菌、停乳链球菌、乳房链球菌分别是辽宁沈阳19.7%和上海14.4%、江苏徐州27.1%和湖北33.3%、新疆石河子20.3%和广西南宁15.4%最优势的种群。

3.1.2. 其他细菌种群的地区分布特征

腐生葡萄球菌和克雷伯氏细菌在少数地区分布相对丰富，前者检出率为北京13.8% > 黑龙江哈尔滨7.8% > 贵州贵阳7.0% > 上海5.2% > 河北衡水3.7%，后者检出率为湖北8.3% > 上海8.2% > 黑龙江哈尔滨3.8% > 新疆石河子2.9% = 广东深圳2.9%。化脓链球菌、牛链球菌、粪链球菌、乳链球菌等4种链球菌只在少数地区被检测到。其中，化脓链球菌的检出率为广西南宁7.7% > 黑龙江哈尔滨5.4% > 四川成都3.7% > 河南郑州3.2% > 广东深圳2.0%；牛链球菌的检出率为广西南宁6.2% > 上海4.1% > 贵州贵阳2.7%；粪链球菌的检出率为广西南宁4.6% > 河南郑州3.2% > 贵州贵阳1.3% > 北京1.1%；乳链球菌的检出率为广西南宁9.2% > 河南郑州4.8%。绿脓杆菌的检出率为 > 四川成都7.4% > 广东深圳2.0% > 内蒙古呼和浩特 = 河南郑州1.6%；变形杆菌的检出率为四川成都5.6% > 上海4.0% > 广东深圳2.9% > 河南郑州1.6% > 河北衡水0.6%；微球菌的检出率为广东深圳3.9% > 贵州贵阳3.5%；芽孢杆菌的检出率为上海3.1% > 新疆石河子2.9%；沙门氏菌的检出率为江苏徐州2.2% > 广东深圳1.0%。枯草杆菌、沙雷菌、四联球菌只在新疆石河子被检测到，检出率分别为16.0%、2.9%、4.3%；巴氏杆菌和多杀性巴氏杆菌只在四川成都被检测到，检出率为5.6%；牛棒状杆菌只在上海被检测到，检出率为3.1%。

3.1.3. 酵母菌种群的地区分布特征

18个省市区中，酵母菌只在广东深圳、新疆石河子、上海、河南郑州等4个省市区中被检测出，检出率分别为3.9%、2.9%、2.1%、1.6%。

3.1.4. 其他微生物类群的地区分布特征

辽宁沈阳其他微生物类群累计检出率占52.7%，包含乳房链球菌等16类细菌(见1.1)，上海、广东深圳、贵州贵阳、河南郑州、北京和广西南宁其他微生物类群依次占11.3%、8%、7.6%、1.6%、6.9%和6.2%。黑龙江哈尔滨独有的柠檬酸盐杆菌和新疆石河子独有的奇形变异菌分别为4.3%和2.9%。

3.2. 我国不同地区奶牛乳房炎病原菌种群及群落间差异性或相似性分析

3.2.1. 病原菌不同种群间差异性或相似性分析

除了一些众所周知的英文缩写，如IP、CPU、FDA，所有的英文缩写在文中第一次出现时都应该给出其全称。文章标题中尽量避免使用生僻的英文缩写。由图2纵向种群聚类分析可知，金黄色葡萄球菌

位居6大优势种群之首独占一个分支，说明金黄色葡萄球菌是致病几率最高且最普遍的奶牛乳房炎病原菌。大肠杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌、表皮葡萄球菌等4个种群聚为一簇，说明其是绝大部分地区诱发奶牛乳房炎极其重要的病原菌种群。除其他微生物类群外，乳房链球菌、腐生葡萄球菌、枯草杆菌、克雷伯氏菌逐级占据一个分支，说明这些病原菌种群在整个奶牛乳房炎研究区中占有较高的份额，致病几率逐级降低。链球菌属中化脓链球菌、牛链球菌、粪链球菌、乳链球菌4个种群逐级聚为一簇，说明其致病几率亦呈现逐级降低趋势。变形杆菌、绿脓杆菌、多杀性巴氏杆菌和巴氏杆菌逐级占据1个小分支；其余7个种群中微球菌种群占据相对较大的份额和剩余6个种群聚为一类。剩余6个种群又划分为2个更小的分支，沙门氏菌与牛棒状杆菌和芽孢杆菌逐级聚在一起，酵母菌与四联球菌和沙雷菌逐级聚为一类。整体而言，检出率越高的种群所在的分支越大，致病几率越高，因此金黄色葡萄球种群致病几率最高，沙门氏菌、牛棒状杆菌、芽孢杆菌和酵母菌、四联球菌、沙雷菌等种群致病几率最低。具体不同种群的致病几率依次为：金黄色葡萄球菌分支 > 大肠杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌、表皮葡萄球菌分支 > 乳房链球菌分支 > 腐生葡萄球菌分支 > 枯草杆菌分支 > 克雷伯氏菌分支。其他链球菌属小分支中化脓链球菌、牛链球菌、粪链球菌、乳链球菌的致病几率依次降低；微球菌分支的致病几率 > 剩余小分支。

3.2.2. 病原菌不同地区群落间差异性或相似性分析

由图2横向群落聚类分析可知，18个省市区中辽宁沈阳病原菌群落独占一个最大的分支，这是因为辽宁沈阳奶牛乳房炎病原菌种群结构非常简单(仅4种)，而且其他微生物类群占据最高的份额(检出率为52.7%)。另一大分支划分为重庆为首的亚分支和湖北等地区亚分支。就第二大分支不同地区群落间差异而言，重庆 > 甘肃兰州 > 河北衡水 > 陕西渭南 = 安徽；湖北 = 江苏徐州 > 新疆石河子 > 其他9个地区；其他9个地区细分为2簇3小分支。其中1簇1小分支广东深圳病原菌群落差异 > 内蒙古呼和浩特和河南郑州；另1簇2小分支为广西南宁病原菌群落差异 > 黑龙江哈尔滨和上海，四川成都 > 北京和贵州贵阳地区。

重庆、甘肃兰州、河北衡水、陕西渭南或安徽逐级聚为一簇是因为这些地区奶牛乳房炎病原微生物种群结构相对简单(5~9种)，而且1~2个种群占据极高的份额，例如重庆地区奶牛乳房炎病原菌群落包含5个种群，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌种群检出率分别高达42.8%和28.6%，合计占71.4%，因此独享1个分支；甘肃兰州奶牛乳房炎病原菌群落包含5个种群，金黄色葡萄球菌种群就占据61.5%的份额，另外无乳链球菌和大肠杆菌种群分别占据15.4%的份额，三者合计92.3%，因此独占1分支；河北衡水奶牛乳房炎病原菌群落虽包含9个种群，物种数相对丰富，但金黄色葡萄球菌和大肠杆菌种群均占据35.8%的份额，二者合计71.6%，因此独占一分支；陕西渭南和安徽地区奶牛乳房炎病原菌群落分别包含5和6个种群，相似的优势菌种群占据的份额极其相似，所以共享1个分支。

湖北与江苏徐州奶牛乳房炎病原菌群落均包含7个种群，除了江苏徐州金黄色葡萄球菌和无乳链球菌种群、湖北地区克雷伯氏菌和大肠杆菌种群份额相对偏高外，优势菌种群占有大致相似的份额，所以共享1各分支；新疆石河子奶牛乳房炎病原菌群落在此分支中相对特殊，可能和突然升高的种群数量有关(从湖北与江苏徐州的7个种群跨越到12个种群)；其他9个地区奶牛乳房炎病原菌群落大同小异，除内蒙古呼和浩特、黑龙江哈尔滨和北京种群数量不足10个外，其他6各地区种群数量都在11~18之间，而且有大致相似的种群分布特征，因此9个地区共同占据一个较大的分支。

4. 讨论

众所周知，动植物具有明显的地域分布特征。本研究选择水热气候条件不同的7个地理分区对奶牛乳房炎奶源病原菌群落进行研究。基于传统分离鉴定的病原菌种群检出率相似性，发现奶牛乳房炎奶源病原菌群落未表现出明显的水热分区规律。例如，华北暖温带半湿润区的北京 [1] 先和西南亚热带湿润区的贵州贵阳 [18] 聚为一类，再和西南亚热带湿润区的四川成都 [17] 聚在一起；华东北亚热带湿润区的上海 [15] 和东北寒温带–温带半湿润–湿润区的黑龙江哈尔滨 [8] 聚为一类，再和华南亚热带湿润气候区的南宁 [12] 聚在一起；华中暖温带–亚热带、湿润–半湿润区的河南郑州 [10] 和华北温带半干旱区的呼和浩特 [3] 聚为一类，再和华南亚热带湿润区的广东深圳 [11] 聚在一起；上述9个地区再和西北温带干旱区的新疆石河子 [6] 聚在一起。另外，东北暖温带半湿润区的辽宁沈阳 [7] 作为最大的一级分支和其他17个省市区聚在一起。二级分支中，西南亚热带湿润区的重庆 [16] 、西北温带干旱区的甘肃兰州 [4] 、华北温带半湿润半干旱区的河北衡水 [10] 、西北温带干旱区的陕西渭南 [5] 或华东暖温带-亚热带湿润区的安徽 [13] 逐级聚在一起；华东暖温带湿润半湿润区的江苏徐州 [14] 与华中亚热带湿润区的湖北 [9] 和剩余10个省区聚在一起。

尽管权威的微生物生物地理学研究证实微生物群落也具有与宏生物类似的时空分布特征 [23] [24] [25] [26] ，Deb等 [27] 和Roesler等 [28] 认为奶牛乳房炎病原菌的空间变化取决于气候和动物自身差异。本研究中不同地区奶牛乳房炎病原菌群落组成有差异性但并未表现出有规律可循的地区分布特征。原因可能是集约化和规模化养殖推广后，现代人为管理因素的影响远超过自然水热气候及植被等历史因素的影响。陈礼明等 [17] 经流行病学调查研究，发现成都、洪雅和雅安各地的临床型乳房炎夏秋季节发病率高于春季和冬季。Olde等 [29] 研究发现由乳房链球菌引起的临床乳腺炎发病率和牧场有关，然而由大肠杆菌引起的临床乳腺炎发病率更多和圈舍有关；季节差异对优势病原菌的影响大，例如，完全密闭的牛群夏季比冬季有较高的大肠杆菌型临床乳腺炎发病率 [29] 。本研究中分离鉴定的病原菌多为乳房炎高发季节规模化牛场和少数散养户乳样，文献虽未具体研究区域气候及圈舍条件影响，但不排除气候及季节差异 [6] [7] [17] 和圈舍条件 [1] [3] [5] [6] [7] [8] [9] [13] [14] [17] [18] 对病原菌群结构组成的影响。Justice-Allen等 [30] 认为再生砂垫层是支原体滋生和繁殖的重要场所，适宜温度和降雨是促进再生砂垫层支原体诱发奶牛乳房炎的重要环境条件。Pieper等 [28] 研究发现患病牛群比对照牛群有较低的金黄色葡萄球菌发生率和较高的酵母菌发生率，但本研究7个地理分区18个省市区奶牛乳房炎牛群酵母菌发生率明显低于金黄色葡萄球菌等优势细菌发生率。Abera等 [31] 研究发现泌乳后期乳房炎发生率41.3%高于早期25.0%和中期22.1%，牛床垫料有无、垫料类型等饲养环境和卫生条件是诱发乳房炎的关键因素，但年龄、胎次和乳房炎病史与奶牛乳房炎的发生没有相关性。曹俊俊等 [1] 调查发现，隐性乳房炎感染率的高低与饲养管理、环境卫生条件、病原菌致病力强弱等因素有直接关系。邓海平等[3]研究发现内蒙古呼和浩特地区奶牛乳房炎的病原菌类群主要包括通过牛体、泥土、粪便等传播的环境性致病菌(表皮葡萄球菌、乳房链球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、停乳链球菌等)和通过挤奶过程接触传播的传染性病原菌(无乳链球菌与金黄色葡萄球菌等)。Lakew等 [32] 研究发现不同品种间泌乳期奶牛乳房炎患病率存在显著差异，挤奶过程中良好的卫生措施、剔除慢性乳腺炎载体、治疗临床感染奶牛，干奶期治疗均能降低传染性乳房炎的患病率。Zhao等 [33] 认为乳腺组织的破坏也是奶牛乳房炎的诱因。这说明畜间(品种、年龄、胎次、泌乳月、乳腺组织完好与否)差异、人为管理模式(垫层有无与类型、圈舍温湿度、卫生条件等)差异、可能的饮食结构差异等因素对奶牛乳房炎病原菌群落的分布有重要影响，但本研究中历史性的自然水热气候条件及植被因素并非驱动奶牛病原菌群落地区分布的决定性因素。Gordon等 [34] 研究发现“拴养”圈舍临床型乳房炎发病率主要受区域因素(山区生产带、牛群更换系统、农场主年龄)影响；“非栓养”圈舍，临床型乳房炎发病率主要与圈舍气候、温度和垫面的舒适度等因素有关。

另外，样本采集量、采样方法、培养和分离鉴定法、检测精准度对研究结果有重要影响，尽管本文所选7个地理分区18个省市区病原菌群都源自传统的分离培养及生理生化鉴定法，但采样量有明显区别(表1)。Oikonomou等 [35] 通过高通量测序一次性获得多达60个已知种和几将近50%的未分类细菌种，高通量测序获得的病原菌种群数量 [35] [36] [37] 远超过传统分离鉴定方法获得的奶牛乳房炎病原菌种群数量。此外，统计口径不同可能是造成奶牛病原菌群落差异的关键因素。例如，辽宁沈阳奶牛乳房炎病原菌群落接近20个种属 [7] ，但由于大多数种属没有单独计算检出率，统计口径明显不同于其他17个省市 [1] - [6] [8] - [18] ，导致其独占1个大分支。部分资料病原菌种属划分模糊、研究时空尺度和技术分析手段等不统一问题也可能是造成不同奶牛乳房炎病原菌群落差异的重要方面。

综上所述，不同地区奶牛乳房炎病原菌种群复杂，可能与区域气候条件 [3] [8] 、季节变化 [6] [8] [17] 、地理位置 [3] [5] [12] [13] 以及不同地区牛场的卫生管理措 [1] [3] [5] [6] [7] [8] [9] [13] [14] [17] [18] 有关。因此，不同地区应根据具体情况实施对奶牛乳房炎进行及早预防和正确诊疗。同时，注意保持牛舍内外清洁和牛体卫生、避免挤奶过程中的交叉感染。

5. 结论

我国7个地理分区的18个省市区共获得30个已知种属及其检出率的类群。不同地区奶牛乳房炎病原菌群落组成、优势种群及稀有种群存在明显差异，影响因素复杂。建议规范病原菌种属名称，统一研究时空尺度和技术分析手段，利用宏基因组学高通量技术从群落生态学角度探究地区间温湿度差异及畜间差异，不同管理模式、饮食结构和饲养环境等因素对病原菌群变化的影响，以期为流行病学和预防医学研究重点提供基础数据。

基金项目

感谢国内外学者提供的优质文献资料，感谢国家自然科学基金项目(No. 31660724, No. 41361053)、内蒙古自然科学基金项目(No. 2015MS0306, No. 2016MS0331)的支持。感谢审稿专家对该论文提出的宝贵意见。

参考文献

参考文献