1. 引言

广东虫草(Cordyceps guangdongensis)是2005年在广东发现的，2008年发表的虫草类食用真菌 [1]。2013年1月，广东虫草子实体被国家卫生部正式批准为新资源食品。目前的研究发现其具有良好的抗疲劳 [2]、延寿 [3]、抗氧化 [4]、抗禽流感病毒 [5]、防治慢性肾衰竭 [6] 及免疫调节 [7] 等作用。

本研究将不同剂量广东虫草酒添加到果蝇基础培养基中饲养果蝇，以探究不同剂量广东虫草酒对果蝇寿命的延长作用，随后通过测定各组果蝇组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量来探究广东虫草酒的抗氧化作用。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 供试材料

广东虫草酒：由浙江泛亚生物医药股份有限公司提供；黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)由中国科学院上海植物生理生态研究所提供。

2.1.2. 仪器与试剂

H1650-W高速离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；ME204电子天平：梅特勒–托利多国际贸易有限公司；721型分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；HPX-300BSH-3恒温恒湿培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司。

冰醋酸、无水乙醚：上海凌峰化学试剂有限公司；SOD试剂盒、MDA试剂盒、TP试剂盒：南京建成生物工程公司。

2.2. 方法

2.2.1. 果蝇培养基的配置

基础培养基配方：玉米粉108.5 g、琼脂8.2 g、蔗糖81.5 g、酵母粉9.2 g、冰醋酸6 ml、水1000 ml。

配置方法：将琼脂8.2 g，蔗糖81.5 g，放入锅中，加入100 ml热水，搅拌溶解，然后加入108.5 g玉米粉，再加800 ml热水，充分搅拌，加热成糊状，关火；再加冰醋酸5 ml以及溶于100 ml凉水的9.2 g酵母粉，搅拌均匀，然后立即悬空装入培养管中，每管培养基高约2 cm (大约10 ml)，盖上瓶塞，报纸封口，121℃高压蒸汽灭菌30 min，置于超净台自然冷却，放置2 d使水汽蒸发，即获得基础培养基。灭菌后在培养基未凝固前加入特定量的样品，制成实验培养基。

2.2.2. 不同含量广东虫草酒对果蝇寿命影响的测定

以在基础培养基中分别添加0.5%，1%，5%的广东虫草酒样品饲养的果蝇为实验组，以在基础培养基中分别添加0.5%，1%，5%的基酒样品饲养的果蝇为对照组，以仅用基础培养基饲养的果蝇为空白对照组。选取8小时内羽化成虫的果蝇，用乙醚麻醉后挑选出雌雄果蝇，每个培养管饲喂10只果蝇，雌雄分开，各设置3个重复，25℃恒温60%恒湿培养，每天查看果蝇存活情况并进行记录，最后统计果蝇平均寿命，半数死亡时间及最高寿命。

2.2.3. 不同含量广东虫草酒对果蝇体内SOD活性及MDA含量的影响

果蝇1%组织匀浆的制备：以在基础培养基中分别添加0.5%，1%，5%的广东虫草酒样品饲养的果蝇为实验组，以在基础培养基中分别添加0.5%，1%，5%的基酒样品饲养的果蝇为对照组，以仅用基础培养基饲养的果蝇为空白对照组。选取8小时内羽化成虫的果蝇，用乙醚麻醉后挑选出雌雄果蝇，每个培养管饲喂10只果蝇，雌雄分开，各设置3个重复，25℃恒温60%恒湿培养30天后准确称量每组果蝇的质量(精确到0.001 g)，用0.9%的生理盐水充分研磨配制成1% (w/V)的果蝇组织匀浆，并于4000 r/min离心15 min，取上清液备用。

果蝇组织中可溶性蛋白含量测定：按照试剂盒说明书进行操作，每组3个重复，各取50 ul的1%果蝇组织匀浆，进行蛋白含量测定。样本蛋白浓度按照下列公式计算。

$待测样本蛋白浓度\left(\text{mgprot}/\text{ml}\right)=\frac{O{D}_{测定}-O{D}_{空白}}{O{D}_{标准}-O{D}_{空白}}\times 标准品浓度\left(\text{mgprot}/\text{ml}\right)$

果蝇组织中SOD活力的测定：按照试剂盒说明书进行操作，每组3个重复，各取50 ul果蝇组织匀浆，进行SOD活力测定。SOD活力按照下列公式计算。

$SOD活力\left(\text{U}/\text{mgprot}\right)=\frac{O{D}_{测定}-O{D}_{空白}}{O{D}_{标准}-O{D}_{空白}}/50\text{\%}\times \frac{反应总体积}{取样量}相同匀浆浓度蛋白含量\left(\text{mgprot}/\text{ml}\right)$

果蝇组织中MDA含量的测定：按试剂盒说明书操作，每组3个重复，各取100 ul果蝇组织匀浆，进行MDA含量测定。MDA含量按照下列公式计算。

$MDA含量\left(\text{nmol}/\text{ml}\right)=\frac{O{D}_{测定}-O{D}_{空白}}{O{D}_{标准}-O{D}_{空白}}\times 标准品浓度\left(\text{10nmol}/\text{ml}\right)\times 相同匀浆浓度蛋白含量$

2.2.4. 数据统计分析

实验数据使用SPSS Statistics 17.0软件进行数据处理和分析，实验结果用平均值±标准差表示。

3. 结果与分析

3.1. 广东虫草酒对果蝇寿命的影响

以在基础培养基中分别添加0.5%，1%，5%的广东虫草酒样品饲养的果蝇为实验组，以在基础培养基中分别添加0.5%，1%，5%的基酒样品饲养的果蝇为对照组，以仅用基础培养基饲养的果蝇为空白对照组，按照2.2.2的方法评价了广东虫草酒对果蝇寿命的影响。实验结果如表1和表2所示。

从表1的结果来看，对于雌果蝇来说，培养基中加入的基酒越多，果蝇的寿命越短，甚而低于空白对照组；而加入虫草后，其能抵消基酒带来的寿命下降，果蝇寿命普遍有所提高，其中0.5%和5%虫草酒的两组相比于同添加量基酒组对果蝇平均寿命和半数死亡时间有显著提高(p < 0.05)。而1%虫草酒组与1%基酒组相比，对果蝇平均寿命和半数死亡时间的提升不够显著，但其对果蝇最高寿命的提升具有显著性(p < 0.05)。

注：表中a、b、c表示同性果蝇不同处理组间的显著性差异(p < 0.05)。

与空白对照组比较，当虫草酒添加量为0.5%时，果蝇平均寿命、半数死亡时间、最高寿命均有显著性提升(p < 0.05)，分别提高了18.36%、10.6%、8.46%，对雌果蝇寿命增加作用最强。

注：表中a、b、c表示同性果蝇不同处理组间的显著性差异(p < 0.05)。

从表2来看对于雄果蝇来说，培养基中加入基酒越多，果蝇的寿命越长。而加入虫草酒后，果蝇寿命有所提高，加入量越多，果蝇寿命越长。相同添加量的虫草酒组和基酒组相比，平均寿命和半数死亡时间均有所提高但未达到显著水平，而1%，5%添加量的虫草酒组与基酒组相比对最高寿命有显著提升(p < 0.05)。在供试范围内，当虫草酒添加量为5%时，果蝇平均寿命、半数死亡时间和最高寿命均最高，且与空白对照组比较有显著性差异(p < 0.05)，分别提高了16.38%、10.05%和10.8%，对雄果蝇寿命增加作用最强。

综上来看，广东虫草酒对果蝇寿命有提升作用。对于雌果蝇，加入0.5%的虫草酒时其寿命提升最高，对于雄果蝇，加入5%的虫草酒时其寿命提升最高。

3.2. 广东虫草酒对果蝇SOD活性和MDA含量的影响

以基础培养基饲养的果蝇为空白对照，将在添加了不同数量样品培养基中培养了30 d的果蝇制成1%组织匀浆，按照试剂盒的方法测定组织匀浆的SOD活力和MDA含量。测定结果如表3及表4所示。

注：表中a、b、c表示同性果蝇不同处理组间的显著性差异(p < 0.05)。

从表3中可以看出，对于雌果蝇，只有0.5%虫草酒组相比于对应的基酒组和空白对照组体内的SOD活力有显著提升(p < 0.05)，其比空白对照组提高了11.35%，其它组有所提升但不显著。对于雄果蝇，1%和5%虫草酒组均比相对应的基酒组对SOD活力有显著提升(p < 0.05)，但与空白对照相比，只有5%虫草酒组SOD活力具有显著提升，提升了11.78%。

注：表中a、b、c表示同性果蝇不同处理组间的显著性差异(p < 0.05)。

从表4结果来看，雌果蝇5%虫草酒组比相应基酒组对MDA含量显著降低，但与空白对照组相比，0.5%虫草酒组雌果蝇MDA含量降低显著，降低了10.44%。

对于雄果蝇，1%，5%虫草酒组比相应基酒组MDA含量均有显著降低(p < 0.05)，且5%虫草酒组雄果蝇的MDA含量相比空白对照组差异极显著(p < 0.01)，降低了20.72%。

综合SOD活力和MDA含量的结果来看，广东虫草酒能提升SOD活力并降低MDA含量，表明广东虫草酒具有抗氧化作用。其中0.5%添加量的广东虫草酒对雌果蝇具有较高的抗氧化作用；而对于雄果蝇，5%添加量的广东虫草酒抗氧化作用更显著。

4. 结论与讨论

果蝇是双翅目果蝇属昆虫，因其具有繁殖快、周期短、繁殖多，且代谢途径、生理功能和发育阶段同哺乳动物相似等优势而常常作为模式动物被用于抗衰老研究 [8]。超氧化物歧化酶(SOD)对机体氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，其能清除超氧阴离子自由基(O− 2)保护细胞免受损伤 [9]。氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化作用，会形成丙二醛(MDA)等脂质过氧化物 [10]。因此SOD的测定与MDA的测定能相互配合，前者反应机体清除氧自由基的能力，后者反应机体细胞受氧自由基攻击的损伤情况 [11]。本研究采用果蝇作为实验动物，研究了广东虫草酒不同添加量对果蝇寿命的影响，并以超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量为指标探究了其抗氧化活性。

在对果蝇寿命影响方面，0.5%添加量的广东虫草酒显著提高了雌果蝇的平均寿命、半数死亡时间和最高寿命(p < 0.05)，分别比空白对照组提高了18.36%、10.6%、8.46%；5%添加量的广东虫草酒显著地提高了雄果蝇的平均寿命、半数死亡时间和最高寿命，分别比空白对照组提高了16.38%、10.05%和10.8%；1%添加量的广东虫草酒显著提高了雄果蝇最高寿命。这些结果表明广东虫草酒具有延长果蝇寿命的作用，且雌雄果蝇延寿效果显著时广东虫草酒的添加量有所不同。

在抗氧化作用方面，0.5%添加量的广东虫草酒显著提高了雌果蝇体内SOD活力，并显著降低了其MDA含量，与空白对照相比分别提升和降低了11.35%和10.44%；5%添加量的广东虫草酒则显著提高了雄果蝇体内SOD活力，且对雄果蝇体内MDA含量降低显著，与空白对照组相比分别提升和降低了11.78%和20.72%。该结果表明，广东虫草酒对雌雄果蝇均表现出抗氧化作用，但添加量有所不同。

果蝇培养基内0.5%，1%，5%的虫草酒添加量对应的人体每日推荐量(以体重60 kg计) [12] 分别为15 ml，30 ml，150 ml。因此，我们的研究结果还能作为制定合适的广东虫草酒每日推荐饮用量的一个依据。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献