1. 引言

自从2011年细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA-4)单克隆抗体Ipilimumab (Yervoy^®)上市以来，以免疫检查点疗法(Immune Check Point Therapy, ICT)为代表的肿瘤免疫治疗取得了快速发展，目前全球已有25款ICT单抗药物获批上市，用于治疗超过20类肿瘤、涉及100多项适应症 ‎[1] 。ICT持久的临床反应给患者带来了前所未有的治疗效果。例如，PD-1单抗Nivolumab (Opdivo^®)联用Yervoy治疗晚期黑色素瘤的6.5年存活率高达49% ‎[2] 。此外，另一款PD-1单抗Pembrolizumab (Keytruda^®)治疗进展性黑色素瘤的7年生存率达到37.8% ‎[3] ，2023年该药的销售量已突破250亿美元，因此成为全球最畅销的药物 ‎[4] 。毫无疑问，ICT彻底改变了肿瘤的治疗模式，让广大癌症患者看到了生的希望。然而，ICT单抗药物也存在一些不足，其中最大的问题是大多数肿瘤患者对ICT不响应，加上单抗药物作为蛋白类分子存在免疫原性较强、代谢缓慢、渗透性差、生产成本高、仅能注射给药等问题，限制了ICT在临床中的应用。相比于单抗，小分子具有结构简单、易于改造和修饰、免疫原性低、透膜性强、可口服给药等优点，因此在临床拥有较大需求的当下，研发PD-1/PD-L1小分子抑制剂有着广阔的应用前景。

2. PD-1/PD-L1信号通路

2.1. PD-1/PD-L1的结构与功能

PD-1 (CD279)是由288个氨基酸组成的I型跨膜蛋白，主要表达在免疫细胞的表面，并拥有PD-L1 (B7-H1, CD274)和PD-L2 (B7-DC, CD273)两个配体 ‎[5] 。PD-1由N端免疫球蛋白可变区(IgV)、跨膜区和胞内尾部组成，且尾部拥有两个功能不同的酪氨酸功能序列 ‎[6] ，分别为“基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)”和“基于免疫受体酪氨酸的开关基序(ITSM)” ‎[7] 。由于PD-1的尾部缺少构成二聚体较为重要的Cys残基，细胞膜上的PD-1被认为以单体形式存在。PD-L1为包含C端免疫球蛋白可变区(IgC)和IgV结构域的I型跨膜糖蛋白，其胞质结构域较短，容易触发细胞间信号传导 ‎[8] 。PD-L1可作为一种可溶形式(sPD-L1)存在，其保留与PD-1相互作用的IgV配体结构域 ‎[9] ，并且可作为单抗治疗后的肿瘤进程早期标志物 ‎[10] 。在生理条件下，PD-1与PD-L1结合便当作负性免疫调节因子以防过度免疫，因此其作为免疫检查点的共抑制分子在维持机体免疫稳态中起重要作用。在肿瘤微环境(TME)中，PD-1/PD-L1过度激活会协助肿瘤细胞逃避免疫攻击 ‎[11] 。

2.2. PD-1/PD-L1与肿瘤免疫逃逸的相关性

多项研究表明，PD-L1在人类多种实体肿瘤过表达，而且部分癌症患者血浆中还出现PD-L1过表达的现象。目前普遍认为PD-L1过表达与多种肿瘤的不良预后相关 ‎[12] 。在TME中，由肿瘤浸润性免疫细胞产生的各种促炎细胞因子(如γ-干扰素)通过诱导PD-L1表达形成免疫抑制性微环境，从而促进肿瘤发展。当肿瘤细胞表面的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合后，PD-L1的下游通路如ITIM和ITSM会招募Src同源磷酸酶1和2，将CD28和TCR下游信号通路中的关键蛋白去磷酸化，导致TCR无法识别肿瘤细胞上的MHCI，进而发生肿瘤免疫逃逸 ‎[13] 。此外，PD-1/PD-L1信号通路还能够阻碍T细胞周期的进程和促进调节性T细胞的增殖，使T细胞原有的免疫功能逐渐丧失，产生T细胞衰竭现象，进一步加剧免疫逃逸 ‎[14] 。正因如此，自从2014年首款PD-1单抗Opdivo上市至今，全球先后已有22款PD-1/PD-L1单抗获批上市，因此PD-1及其配体PD-L1成为肿瘤免疫治疗领域开发最为成功的靶标。这些单抗通过与PD-1或PD-L1结合，阻断PD-1与PD-L1结合，从而逆转PD-1/PD-L1介导的免疫逃逸，有效恢复T细胞的抗肿瘤功能。

3. PD-1/PD-L1小分子抑制剂的研发

然而，PD-1/PD-L1小分子抑制剂的研发却举步维艰，目前全球尚无一款该类小分子抑制剂上市。这一方面反映了PD-1/PD-L1小分子抑制剂的研发远远落后于单抗，另一方面也暗示了小分子抑制剂的赛道充满着机遇与挑战。

3.1. 联苯类小分子抑制剂的发现

PD-1/PD-L1小分子抑制剂研发的艰难与蛋白–蛋白相互作用(PPI)的特性相关。传统的PPI的接触面积大，并且表面较为平整，难以留有容纳小分子的空腔，而小分子往往不足以阻碍两个蛋白的相互接触，导致PPI小分子抑制剂研发极具挑战 ‎[15] 。

直到2015年，作为现代肿瘤免疫治疗的先驱，百时美施贵宝(BMS)公司首次公开了一类具有联苯甲基片段的PD-1/PD-L1小分子抑制剂，该类化合物结构中存在多处可供改造与修饰的位点，因此很快便引起人们的关注。2016年，波兰雅盖隆大学Holak课题组率先解析了该类联苯抑制剂BMS-202和PD-L1结合的共晶结构(图1左，PDB:5J89)，结果显示，联苯类化合物能够有效地诱导PD-L1产生二聚化，而且重要的是，小分子占据的二聚体形成的口袋限制了PD-1/PD-L1的结合，从而抑制PD-1/PD-L1信号通路 ‎[16] 。值得一提的是，二聚化的PD-L1可被细胞内吞并降解 ‎[17] 。这一独特的诱导二聚化机制使得该类化合物有希望成为继Bcl-2抑制剂Venetoclax的第二款PPI药物，因此众多业界和机构纷纷以BMS化合物作为先导化合物开展结构改造、修饰和优化研究。

直到2023年为止，BMS公司陆续公开了12份PD-1/PD-L1小分子抑制剂专利，扩展了联苯类化合物的类型(图2)，如以BMS-1058为代表的众多长链结构，提示分子结构左侧苯环有较大的空间可供容纳亲水片段，后续的晶体解析中发现原本左侧的^ATyr56处于易摆动状态，可由较长的片段打开(图1右，PDB: 6RPG) ‎[18] 。然而直到最新公开的专利为止，BMS公司仍未将任何一款PD-1/PD-L1小分子抑制剂推向临床，这使得以联苯骨架分子为先导化合物进行改造的课题组和公司在探索中尤为注重自身化合物成药性的评价。

图2. BMS公司专利公布的代表性联苯类抑制剂 ‎[19] ‎[20] ‎[21]

3.2. 小分子抑制剂的临床研究进展

目前，进入临床开发的PD-1/PD-L1小分子抑制剂多为联苯类化合物或其类似物，具体涉及国内外13家公司开发的15款候选药物，其中Incyte公司的INCB086550最先进入临床研究，随后该公司还推出INCB099280和INCB099318。目前INCB086550和INCB099280正在开展II期试验，其余13款均在I期临床阶段。表1中列出了大多数目前临床上PD-L1的小分子抑制剂，图3中则列出了部分PD-L1的小分子抑制剂的结构。

图3. 部分临床PD-1/PD-L1小分子抑制剂药物结构 ‎[22] ‎[23] ‎[24] ‎[25]

截止目前，Incyte公司目前共发表了5篇有关临床PD-1/PD-L1小分子抑制剂的文章，分别涉及INCB086550 (图3)、INCB099280 (结构尚未公开)、INCB099318 (结构尚未公开)的I期临床结果。2020年，该公司公布的一项I期临床试验初步结果显示，给予INCB086550治疗后的实体瘤患者细胞表面的游离PD-L1大幅度减少，体内IL-2等因子水平有所提升。表明口服INCB086550可带来与PD-(L) 1单抗相似的T细胞活化效果，证明INCB086550能够阻断患者的PD-1/PD-L1相互作用 ‎[26] 。2021年，Incyte公司进一步公布了针对成年晚期实体瘤患者的I期临床初步数据，主要终点为INCB086550的安全性和耐受性、药理活性剂量和/或最大耐受剂量和II期推荐剂量的确认，次要终点为药代动力学和药效学研究、以及由研究者确定的客观缓解率和疾病控制率。根据试验数据显示截止至2021年4月9日，该研究对79例患者进行了治疗，其中有15例出现了免疫治疗副反应中常见的外周神经性病变，但维持现状后能够自行得到缓解或者改善。最终有68例有效治疗病例，其中客观缓解率为11.8%，疾病控制率为19.1%。另外，临床数据还显示，INCB086550在治疗微卫星高度不稳定型结肠癌中能持续应答5.78个月，甚至更久。总之，该项研究观察到的免疫相关不良反应，除外周神经病变外，其余与单抗药物的相一致，而且INCB086550在治疗PD-1/PD-L1单抗敏感的肿瘤类型中已初步显示令人鼓舞的疗效，因此值得进一步研究 ‎[27] 。

2022年，Incyte公司再度公布INCB086550新的I期临床数据。截至2022年4月1日，临床试验共纳入138名携带晚期实体瘤且Eastern Cooperative Oncology Group评级为0~1级的成年患者接受治疗，剂量范围设置为每天100 mg一次到每天800 mg两次，结果发现超过20%的患者出现治疗性不良事件，50例患者出现严重治疗性不良事件，但未发生剂量限制性毒性。最终121例患者(87.7%)停止治疗，其中90例因疾病进展而停止治疗；10例患者(7.2%)达到部分缓解，2例患者(1.4%)获得完全缓解(肛门鳞状细胞癌，400 mg每日两次)。报告中Incyte公司认为升高剂量时除了观察到免疫介导的外周神经病变发生率增加外，INCB086550的安全性与单抗并无区别 ‎[28] 。目前，Incyte公司正进行INCB086550的II期临床试验，用于治疗非小细胞肺癌等实体瘤 ‎[29] 。

除此之外，Incyte公司还在2020年和2021分别开始了INCB099280与INCB099318的I期临床安全性和耐受性研究，根据后续公开的临床数据显示，与INCB086550相比，这两款候选药物耐受性总体良好，并且均未发生剂量限制性免疫介导的外周神经病变，因此值得进一步开展临床研究 ‎[30] ‎[31] 。

毫无疑问，现阶段Incyte公司在PD-1/PD-L1小分子抑制剂临床研究中推进力度最大。随后Gilead开发的GS-4224 (图3)于2019年8月成为第二款进入I期临床试验的PD-1/PD-L1小分子候选药物(NCT04049617)，然而目前从美国临床试验数据库查到该药已终止临床试验，具体原理不详，且尚无临床试验数据。于此同时，我国药企的小分子临床开发也不甘示弱，其中天津红日药业开发的IMMH-010 (图4)率先于2019年在国内申请开展临床研究。IMMH-010是由中国医学科学院药物研究所冯志强课题组研发的YPD-29B异丙酯前药，为联苯类化合物。YPD-29B的结构与BMS-1066骨架较为相似，但采用溴原子替换联苯片段中的甲基便使其抑制活性显著提高。IMMH-010的马来酸盐临床前体内药效评价表明，在携带hPD-L1 MC38细胞的hPD-1小鼠荷瘤模型中给予IMMH-010的马来酸盐(10 mg/kg, p.o., qd)，20天后抑瘤率达到了67.9%，与PD-L1单抗组药效无显著差异，而且小鼠的体重未见明显下降，具有较高的安全性 ‎[32] 。随后IMMH-010又进行了种间差异和活性代谢物的检测，结果显示YPD-29B是其主要代谢产物，并且IMMH-010在啮齿动物血浆中迅速转化为原药YPD-29B，而在灵长类动物血浆中却保持相对稳定。这样的差异与酯酶的分布有关，表明设计前药的策略是合理的 ‎[33] ‎[34] 。

再极医药开发的MAX-10181 (图4)是国内第2款进入临床开发的PD-1/PD-L1小分子抑制剂。该化合物主要是用乙烯基替代BMS联苯类抑制剂中潜在的代谢位点——亚甲氧基，并在中心苯环上引入一个三氟甲基来改善理化参数。该公司在2020年美国癌症研究学会(American Association for Cancer Research, AACR)报告了MAX-10181的临床前研究结果，显示该候选药物对人源化小鼠荷瘤的抑制率大幅度优于Keytruda。随后该公司网上公布消息，MAX-10181在澳大利亚和中国开展临床I期试验中展现出良好的安全性、耐受性和药代参数。同时对比于Keytruda，MAX-10181在PD-L1低表达的患者中具有相似的疾病控制率。更重要的是，在单抗耐药或不耐受的病人中MAX-10181获得了积极的疗效数据。2023年10月23日，MAX-10181联合卡培他滨治疗晚期/转移性实体瘤的II期临床研究获得国家药品监督管理局(NMPA)批准。据悉，再极医药将在2024年AACR年会上进行展示MAX-10181治疗脑胶质瘤的动物药效数据 ‎[35] 。

贝达药业开发的BPI-371153是一款可供口服的PD-1/PD-L1小分子抑制剂。该公司官网揭露，临床前数据显示，BPI-371153可有效诱导和稳定PD-L1二聚体的形成及内吞，从而强有力地阻断PD-L1/PD-1相互作用拟用于局部晚期或转移性实体瘤或复发/难治性淋巴瘤患者的治疗 ‎[36] 。目前BPI-371153的结构尚未公开，该公司公开的专利中BPI-13对成年C57雌性小鼠进行药代参数测试结果表明，在给药(5 mg/kg, p.o.)后0.5、2、4 h时药物血浆浓度分别达到558、1990、2430 ng/mL，是综合表现最佳的化合物 ‎[37] 。

阿诺公司开发的AN-4005也是一款可口服的PD-1/PD-L1小分子抑制剂 ‎[38] 。AN-4005于2021年申请进入临床I期，但其结构尚未公开。该公司公开的专利中化合物114的活性最强，其EC₅₀为14 nM (图4) ‎[39] 。化合物114采用构象限制策略，将联苯上的甲基和邻位亚甲氧基衍变成N-亚甲基吡唑环。此外，化合物114较为特殊的一点是右侧亲水片段改为叔胺。

图4. 推测PD-1/PD-L1小分子抑制剂药物结构 ‎[37] ‎[39]

3.3. 临床前小分子的研究进展

除了上述已进入的临床开发阶段候选药物外，国内仍有许多优选的PD-1/PD-L1小分子抑制剂为企业所青睐而被收购(图5)。L7为孙宏斌课题组开发的小分子抑制剂，IC₅₀达到了个位数纳摩尔，SPR实验显示L7与hPD-L1结合的K_D值为3.34 nM，具有很高的亲和性。L7采用苯并噁二唑替代了BMS-1018氰基取代的苯环，分子对接显示该杂环能够与PD-L1蛋白的氨基酸残基形成更多的作用。L7使用前药策略制成乙酯后在SD大鼠体内口服生物利用度达到9.12%，口服半衰期为3.43 h，且在体内代谢后可顺利转化为原药。用L7的乙酯(25 mg/kg, i.g., qd)对携带hPD-L1 MC38细胞的hPD-1小鼠进行实验，30天后肿瘤生长抑制率为44.2%，没有观察到小鼠产生体重减轻的现象 ‎[40] 。L7的相关专利已转让给江苏中旗科技股份有限公司。

蒋晟课题组通过将联苯类抑制剂中的亚甲氧基直接去除得到三联芳环类衍生物，其中化合物24体外活性最强(图5)。难得的是，该化合物在SD大鼠中口服给药的生物利用度达到22%，口服半衰期为6.4 h。小鼠体内药效学评价结果表明，该化合物(40 mg/kg, p.o., qd)对荷CT26细胞BALB/c小鼠移植瘤的抑制率达到57%，而PD-L1单抗组抑瘤率为45% ‎[41] 。该化合物的专利已转让给药康众拓(江苏)医药科技有限公司。

此外，徐云根课题组开发了以II-1为代表的具有长链联苯片段的PD-1/PD-L1小分子抑制剂，主要是将BMS公司的BMS-1058左侧脂肪环片段替换为氨基酸取代的1H-1,2,3-三氮唑(图5)。实验显示II-1对hPD-L1亲和力为0.1-10 nM。实验结果表明该化合物可以剂量依赖性地促进INF‑γ的表达，并且显著高于BMS-202的作用，但略低于Keytruda (5 μg/mL)的效果 ‎[44] 。将II-1制成双乙酯得到前药II-18后使用II-1与II-18对携带MC38-hPD-L1细胞移植瘤的人源化C57BL/6小鼠进行实验，14天后II-1 (25 mg/kg, i.p., bid)抑瘤率为45.8%，而II-18 (25 mg/kg, i.g., bid)抑瘤率为49.6%。而II-1 (25 mg/kg, i.g., bid)抑瘤率较低，表明制备成前药后II-1的口服抗肿瘤效果得到提升。急性毒性实验显示II-1与II-18在更高的剂量下的安全性仍优于较低剂量的BMS-202 ‎[45] 。II-1的相关专利已转让给西安新通药物研究股份有限公司。

图5. 已转让专利中化合物结构 ‎[42] ‎[43] ‎[44]

4. 结语与展望

PD-1/PD-L1小分子抑制剂的研发已经历第十年却仍未有一款药物能够上市，临床进展缓慢使得研究人员开始将目标放在联用靶向蛋白降解嵌合体、双靶点抑制剂和共价抑制剂上，旨在为PD-1/PD-L1药物的开发提供有益的思路。然而目前这些小分子的研发起步较晚，进入临床还需要一段时间。总体而言，PD-1/PD-L1小分子抑制剂的研究已经从早期的火热转变为近期的平稳。与此同时其他免疫检查点单抗的上市也吸引着部分学者转而研究其小分子抑制剂，而不再着眼于PD-1/PD-L1。我们认为限制PD-1/PD-L1抑制剂研发的因素并非科研的热情，而是科技的水平。由于现阶段物理观测技术的限制，人类并未能对联苯类抑制剂如何诱导PD-L1二聚化的过程拥有更细致的认知，仅是通过计算机进行一定程度的模拟 ‎[46] 。因此现阶段对联苯类化合物的改造仍然处于摸索阶段，并且联苯骨架的必要性同时限制了创新，因此研发全新结构骨架的PD-1/PD-L1小分子抑制剂势在必行。

此外，除了向前看到PD-1/PD-L1小分子抑制剂研发的势头，还应当看到临床候选化合物遇到的问题。相比于特异性较高的单抗，小分子的靶向能力弱于单抗，疗效也低于单抗。十年磨一剑，从已公布的INCB086550的临床数据来看其临床表现并非特别理想，而且直至目前INCB086550的II期临床数据仍未公布，因此PD-1/PD-L1小分子抑制剂的研发仍有很长的路要走。

基金项目

国家自然科学基金项目(22277142)。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献