1. 引言

上呼吸道感染是发病率较高的呼吸系统疾病，鼻和咽喉部的症状较为常见，70%~80%的患者是由病毒感染引发，治疗上以抗病毒为主。中药在上呼吸道感染的治疗上具有较大优势 ‎[1] ，研究表明，350种传统药用植物中有63种具有抗病毒作用，涉及病毒23种，其中包括引起上呼吸道感染的呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒等 ‎[2] 。槟榔–草果–厚朴，《温疫论》中载其有“除伏邪，破戾气”的作用，其组方达原饮在现代急性突发传染病的治疗中应用广泛 ‎[3] ，据报道，其在上呼吸道感染的治疗中亦有应用，刘小燕 ‎[4] 、林霜霜等 ‎[5] 用达原饮治疗小儿上呼吸道感染疗效确切，但未见深入研究。基于此，首先通过网络药理学对槟榔–草果–厚朴治疗上呼吸道感染的作用机制做初步研究。

2. 材料与方法

2.1. 槟榔–草果–厚朴活性及作用靶点的获取

1) 进入TCMSP ‎[6] 数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)，分别以3味中药的中文名称为检索词，并设置口服利用度(Oral Bioavailability, OB) ≥ 30和药物类药性(Drug-Like Properties, DL) ≥ 0.18 ‎[7] ，筛选槟榔–草果–厚朴中较高活性的成分及作用靶点。

2) 对于未检索到作用靶点的药物活性成分，进入BATMAN-TCM ‎[8] 数据库(http://bionet.ncpsb.org.cn/)，以药物名称为检索词，检索对应的作用靶点。

3) 对于未在数据库中检测到靶点的药物活性成分，以其2D结构式或Canonical SMILES式，上传Swiss Target Prediction ‎[9] 数据库中进行预测。

4) 整合检索到的活性成分及作用靶点。

2.2. 上呼吸道感染相关靶点的获取

进入Gene Cards ‎[10] 数据库(http://www.genecards.org/)，以“Upper respiratory tract infection”为关键词进行检索，若靶点过多则设定Score大于中位数的目标靶点为上呼吸道感染相关靶点。

2.3. 共同靶点的获取及PPI网络的构建

1) 将药物靶点与疾病靶点上传Venny2.1.0平台，获得共同靶点及韦恩图。

2) 将交集靶点上传至STRING11.0 ‎[11] 数据库(https://string-db.org)构建蛋白相互作用网络(Protein-Protein Interaction, PPI) ‎[12] ，将生物种类设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为“highest confidence”(>0.9)，其余设置均为默认。

3) 将所得PPI网络数据导入Cytoscape3.7.1，利用内置工具进行分析，并对其进行可视化处理。

2.4. PPI网络的拓扑分析与核心靶点获取

利用Cytoscape3.7.1中内置插件CytoHubba，对PPI网络进行核心靶点拓扑分析，得到槟榔–草果–厚朴映射到上呼吸道感染上的核心靶点。

2.5. GO及KEGG通路富集分析

将共同靶点上传Metascape ‎[13] 数据库(http://www.metascape.org/)，对其进行生物过程(Biological Process, BP)、细胞成分(Cellular Component, CC)和分子功能(Molecular Function, MF)的基因本体论GO (Gene Ontology, GO)功能和KEGG_PATHWAY的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析。

2.6. 槟榔–草果–厚朴–活性成分–上呼吸道感染靶点网络的构建

用CytoScape3.7.1构建槟榔–草果–厚朴–活性成分–上呼吸道感染靶点网络，利用内置工具分析活性成分及作用靶点的Degree值，并根据Degree值筛选核心作用靶点及发挥药效的主要活性成分。

2.7. 分子对接验证

进入RCSB PDB ‎[14] 数据库(http://www.rcsb.org/)，以Scientific Name of Source Organism为“Homo Sapiens”、Polymer Entity Type为“Protein”和Refinement Resolution (Å) ≤ 2.5为筛选条件，下载核心作用靶点蛋白的PDB格式文件。又进入Pub Chem ‎[15] 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取药物的核心活性成分的SDF格式文件。最后进入CB-Dock ‎[16] 数据库(http://clab.labshare.cn)，将受体与配体文件进行分子对接，并根据Vina Score值评价靶点与性成分的结合强度，最后将得到的数据导入微生信 ‎[17] 平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化处理。

3. 结果

3.1. 槟榔–草果–厚朴–活性成分及靶点

从TCMSP数据库、BATMAN-TCM数据库和Swiss Target Prediction数据库中，得到活性成分槟榔8个、草果7个、厚朴2个(见表1)，整合后共获得活性成分16个。得到作用靶点槟榔81个、草果238个、厚朴33个，整合后共获得靶点216个。

3.2. 上呼吸道感染相关靶点

从Genecards数据库得到7515个上呼吸道感染相关靶点。

3.3. 槟榔–草果–厚朴–上呼吸道感染靶点PPI网络

通过Venny2.1.0平台和Cytoscape3.7.1，得到韦恩图(见图1)、槟榔–草果–厚朴成分–上呼吸道感染共同靶点190个和槟榔–草果–厚朴成分–上呼吸道感染靶点PPI网络(见图2)，图中节点颜色根据Degree值，由小到大，按照蓝黄红的顺序进行设定，Degree值越大颜色越红。

3.4. 槟榔–草果–厚朴治疗上呼吸道感染的核心靶点

通过Cytoscape3.7.1内置插件CytoHubba插件，以最大集团中心度(Maximal Clique Centrality, MCC)为标准，筛选出排序居前10位的槟榔–草果–厚朴治疗上呼吸道感染的核心靶点，即TNF、IL-6、MMP-9、CASP3、STAT3、AKT1、TGFB1、HIF-1α、IL-1β和PTGS2，核心靶点信息见表2，核心靶点网络见图3。

3.5. GO和KEGG富集分析结果

通过Metascape数据库的GO富集分析，得到槟榔–草果–厚朴190个作用靶点的GO富集分析结果120条，各选择其前20条进行展示(见图4、图5和图6)，涉及对细菌来源分子的反应、对细胞外刺激的反应和炎症反应的调节作用等生物过程；涉及膜筏、突触前膜和细胞器外膜等细胞成分；涉及DNA结合转录因子结合、蛋白激酶结合和蛋白质结构域特异性结合等分子功能。

得到KEGG富集分析结果40条，选其前20条进行展示(见图7)，其中涉及PI3K-AKT、松弛素、NF-κB、cAMP、FoxO等信号通路。

3.6. 槟榔–草果–厚朴–活性成分–上呼吸道感染靶点网络

通过CytoScape3.7.1构建出槟榔–草果–厚朴–活性成分–上呼吸道感染靶点网络(见图8)，该网络图中共有187个节点和34,782条连线，图中节点颜色根据Degree值，由小到大，按照黄红深红的顺序进行设定，Degree值越大颜色越深红。由于活性成分数量较多，故按Degree值进行降序排列，取排名前10的活性成分作为主要活性成分(见表3)。

3.7. 分子对接验证结果

通过CB-Dock数据库得到分子对接结果(见图9)，通常认为结合能低于−4.25 kcal/mol，主要活性成分与核心靶点具有结合性，低于−5.0 kcal/mol，具有良好的结合性，小于−7.0kcal/mol，具有强烈的结合性 ‎[18] ，结果表明槟榔–草果–厚朴的主要活性成分与治疗上呼吸道感染的核心靶点具有结合性，且大部分结合性强烈。

4. 讨论

上呼吸道感染多由病毒如鼻病毒、腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒等引起，细菌感染常继发于病毒感染之后，以甲型溶血性链球菌为最常见，其次为流感嗜血杆菌等 ‎[19] 。上呼吸道感染时，外周血中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8等炎性因子高表达，CD4+、CD8+等T细胞亚群降低 ‎[20] ，部分病毒可通过PI3K-AKT信号通路增强对人体的侵袭 ‎[21] ，而槟榔–草果–厚朴对上述病原有抑制作用，对相关因子和通路也有调节作用，下面进行具体阐述。

4.1. 槟榔–草果–厚朴中主要活性成分的作用机制

槟榔–草果–厚朴–活性成分–上呼吸道感染靶点网络表明，槟榔–草果–厚朴的主要活性成分Quercetin、Procyanidin B1、Daucosterol_qt、Eucalyptol、Neohesperidin等发挥治疗作用。

Quercetin是黄酮类化合物中的主要成分，对呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、鼻病毒、腺病毒等有抑制作用 ‎[22] ‎[23] ‎[24] ‎[25] ，可通过下调AKT1的表达抑制PI3K-AKT信号通路 ‎[26] ，有研究表明，PI3K-AKT信号通路能够增强多种病毒的复制，并可能与RNA和DNA病毒(包括甲型流感病毒)的溶解性感染有关 ‎[21] ，Quercetin还能明显抑制TNF-α诱导下内皮细胞NF-κBRel A的活化，并减少IL-6的表达，抑制程度与槲皮素浓度呈正相关 ‎[27] ‎[28] ；Procyanidin B1是多酚类化合物，能作用于人单核细胞，具有拮抗IL-6抑制IL-1β等细胞因子产生的作用 ‎[29] ，有研究表明，Procyanidin B1能够明显抑制脂多糖(革兰阴性菌外膜的主要成分)介导的炎症反应，且其抗炎活性呈浓度依赖，可能是通过抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用 ‎[30] ；Daucosterol_qt是β-谷甾醇糖苷的化合物，有研究表明，其可抑制IL-6和IL-1β的表达，且随着剂量增加，抑制作用随之增强 ‎[31] ；Eucalyptol是一种氧化萜类化合物，有研究表明，其对呼吸系统炎性疾病具有抗炎、抗氧化的作用 ‎[32] ‎[33] ，可抑制LTB2、PGE2、IL-1β、IL-6、TNF-α和TGFB1的产生 ‎[34] ‎[35] ‎[36] ，其对溶血性链球菌、肺炎克雷伯杆菌有抑制作用 ‎[37] 。此外，还能促进黏液纤毛清除功能，增强气道内细菌如流感嗜血杆菌的清除 ‎[38] ；Neohesperidin是一种酚类化合物，有研究表明，其对革兰阳性菌的抗菌作用高于革兰阴性菌，能有效抑制细菌生长。此外，还能提升免疫力，增强自然杀伤细胞的细胞毒性和吞噬单核细胞比例，提高CD4+和CD8+细胞数等 ‎[39] 。

4.2. 槟榔–草果–厚朴治疗上呼吸道感染通路的作用机制

KEGG富集分析结果表明，槟榔–草果–厚朴中主要活性成分通过PI3K-AKT、松弛素、NF-κB、cAMP、FoxO等信号通路发挥治疗作用。

PI3K-AKT信号通路，是防御病原入侵的重要信号通路之一 ‎[40] ，当发生上呼吸道感染时，PI3K-AKT信号通路可被激活，并通过B细胞和T细胞受体的免疫应答调节机体免疫 ‎[41] ‎[42] ‎[43] ，且还能激活NF-κB上调炎症因子的表达 ‎[44] 。有研究表明，病毒的侵袭和复制可能是通过激活并利用PI3K-AKT信号通路完成的 ‎[40] 。

松弛素信号通路，是一种以松弛素作为配体的信号通路，有研究表明，松弛素可增加MMP-2和MMP-9的表达 ‎[45] ，而MMP-9是诱导炎症因子分泌的关键因子 ‎[46] ，可将IL-8和IL-1β活化，从而影响病理进程。主要的呼吸道病原体，如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和流感嗜血杆菌等，能够诱导MMP-9的产生 ‎[47] 。

NF-κB信号通路，在调节对感染的免疫应答中起关键作用，而异常调节与炎症、癌症和自身免疫疾病等有关。激活后的NF-κB可调控许多因子的转录，如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、iNos、ICAM-1等 ‎[48] ‎[49] ‎[50] ，TNF-α为炎症反应的“开关”，可诱发局部炎症反应 ‎[46] ，IL-2与炎性反应和宿主病毒增殖有紧密联系 ‎[51] 。有研究表明，流感病毒感染小鼠后可上调NF-κB表达 ‎[48] ‎[52] 。

cAMP信号通路，又称PKA系统，有研究表明，cAMP水平的升高可调节炎症反应 ‎[53] ，抑制细胞吞噬、吞噬体酸化、溶酶体酶释放等 ‎[54] 。另有研究表明，体温和cAMP的含量变化呈正相关 ‎[55] ，cAMP还可引起感觉神经元过度兴奋和痛觉过敏 ‎[56] 。

FoxO信号通路，通过调节基因表达参与细胞的生理事件，包括凋亡、细胞周期控制、葡萄糖代谢、氧化应激抵抗等 ‎[57] 。FoxO蛋白家族包括4个亚型FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6，FoxO1为Akt下游基因，PI3K-Akt信号通路激活后，可使FoxO1磷酸化从核内移动到胞质，失去转录活性，抑制细胞凋亡，有研究表明，FoxO1可抑制炎性因子的表达 ‎[58] ‎[59] ‎[60] 。

4.3. 槟榔–草果–厚朴中主要活性成分的分子对接验证

分子对接结果表明，槟榔–草果–厚朴中主要活性成分通过TNF、MMP9、STAT3、AKT1、TGFB1、PTGS2等核心靶点发挥治疗作用。

TNF是一种多效细胞因子，在炎症、细胞凋亡和免疫功能调节中起主要作用，正常情况下，体内浓度较低，有研究表明，革兰阴性菌的内毒素和呼吸道病毒如流感病毒、鼻病毒等能诱导TNF-α、IL-1β、IL-6等的产生 ‎[61] ‎[62] ‎[63] ，使其在体内的浓度升高。其中，TNF-α是呼吸道病毒的重要靶点，在RNA病毒的复制过程中起关键作用 ‎[64] 。

MMP-9是一种锌钙依赖性内肤酶，在炎症反应中起重要作用，有研究表明，MMP-9参与了气道炎症反应 ‎[65] ，MMP-9可在呼吸道上皮细胞基底膜上打孔，促使炎性细胞因子如TNF-α、TGFB的迁移聚集，破坏内皮和上皮结构，参与呼吸道重构和炎症反应 ‎[66] 。

STAT3是JAK的下游效应分子，能协同NF-κB调节TNF-α等炎症因子的表达 ‎[67] ，STAT3在炎症反应中的优先级可能大于NF-κB，IL-6是STAT3主要的胞外刺激因子 ‎[33] ，有研究表明，抑制STAT3的磷酸化，能有效减少IL-1β的分泌 ‎[68] 。

AKT1是PI3K的下游效应分子，有研究表明，抑制PI3K和AKT可降低呼吸道合胞病毒对人体的侵染 ‎[69] 。此外，AKT1显性阴性突变可显著抑制病毒RNA的表达，降低病毒衣壳蛋白的表达和病毒的释放 ‎[70] 。

TGFB1是一种双向性多功能细胞因子，可调节机体炎症反应 ‎[71] ，低浓度TGFB1具有免疫刺激效应，高浓度TGFB1可抑制T细胞、B细胞及巨噬细胞的活性及功能，具有免疫抑制效应 ‎[72] ，有研究表明，TGFB1可通过诱导巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等趋化，并延长炎性细胞存活时间，刺激气道平滑肌细胞释放炎性因子 ‎[73] 。

PTGS2是前列腺素生物合成中的关键酶，受NF-κB调节并受多种刺激转录，在气道炎症的发病机制中起关键作用 ‎[74] ，有研究表明，抑制前列腺素产物能降低cAMP水平，增强宿主的抗菌能力 ‎[75] ，敲除PTGS2基因可增强对铜绿假单胞菌的清除能力 ‎[76] 。另有研究表明，PTGS2是呼吸道合胞病毒、鼻病毒、流感病毒、柯萨奇病毒等多个呼吸道病毒的靶点 ‎[77] 。

5. 总结

综上所述，槟榔–草果–厚朴治疗上呼吸道感染的潜在作用机制涉及抗病毒、抗炎和增强免疫力三方面，主要是以Quercetin、Procyanidin B1、Daucosterol_qt、Eucalyptol、Neohesperidin等活性成分，通过TNF、MMP9、STAT3、AKT1、TGFB1、PTGS2等核心靶点和PI3K-AKT、松弛素、NF-κB、cAMP、FoxO等信号通路，抑制呼吸道病毒如呼吸道合胞病毒、流感病毒、鼻病毒、腺病毒等和呼吸道细菌如溶血性链球菌等，下调炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等的表达，增强自然杀伤细胞的细胞毒性和吞噬单核细胞比例，提高CD4+和CD8+细胞数等，从而缓解鼻和咽喉部症状，达到治疗上呼吸道感染的作用。

由于本研究仅限于网络药理学层面，部分预测内容目前缺乏相应的研究，所以具体的调控机制、关键作用靶点还需通过谱效关系研究、动物或细胞实验等进行验证。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献