摘要: 目的：本研究旨在研究牛蒡提取物是否具有治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)作用。方法：采用高脂饮食(HFD)喂食C57BL/6小鼠12周建立小鼠NAFLD模型，灌胃牛蒡提取物进行治疗。通过生化试剂盒检测小鼠血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的含量变化来观察牛蒡提取物对肝细胞损伤的影响。通过生化试剂盒检测小鼠血清中甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量变化来观察牛蒡提取物对脂质代谢的影响。用HE染色法观察牛蒡提取物对肝脏组织的损伤的影响。结果：HFD喂养小鼠12周后，小鼠发生了肝损伤，血清中AST和ALT的含量显著升高，HE染色结果也显示肝脏组织出现严重的病理损伤；并且也发生了脂质代谢紊乱，血清中TG、TC和LDL-C的含量显著升高。牛蒡提取物治疗可以显著降低NAFLD小鼠的肝损伤和脂质代谢紊乱，主要表现为：灌胃牛蒡提取物后，小鼠血清中的AST、ALT、TG、TC和LDL-C含量显著降低，并且肝脏组织病理损伤也得到显著的改善。结论：牛蒡提取物可以有效减轻HFD诱导的小鼠NAFLD。
Abstract: Aim: To investigate whether
Arctium lappa L. extract has therapeutic effects on non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Methods: NAFLD model was induced in C57BL/6 mice by feeding with high-fat + high-sucrose diet for 12 weeks, and treated with A
rctium
lappa L. extract by gavage. To observe the impact of A
rctium
lappa L. extract on hepatocyte damage, biochemical kits were used to detect changes in aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) levels in mouse serum. Similarly, to investigate the effect of A
rctium
lappa L. extract on lipid metabolism, biochemical kits were employed to measure alterations in triglyceride (TG), total cholesterol (TC), and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) levels in mouse serum. The impact of A
rctium
lappa L. extract on liver tissue damage was assessed using hematoxylin and eosin (HE) staining. Results: After 12 weeks of high-fat diet (HFD) feeding, mice exhibited liver damage, with significant elevations in serum AST and ALT levels. HE staining results also indicated severe pathological damage to the liver tissue. Additionally, lipid metabolism disorder occurred, marked by significant increases in serum TG, TC, and LDL-C levels. A
rctium
lappa L. extract treatment significantly alleviated liver damage and lipid metabolism disorder in non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice, as evidenced by the notable reduction in serum AST, ALT, TG, TC, and LDL-C levels after gavage administration of A
rctium
lappa L. extract, accompanied by significant improvement in liver tissue pathological damage. Conclusion: A
rctium
lappa L. extract effectively mitigates HFD-induced NAFLD in mice.
1. 引言
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征[1]。NAFLD可逐步发展为肝炎、肝硬化和肝癌，最后造成死亡，对人们的健康带来严重的威胁[2]。目前，全球的NAFLD的发病率约为25%，我国NAFLD的发病率约为15%，并且发病人群开始逐步年轻化，这严重威胁着我国人民的生命健康[3] [4]。
虽然NAFLD对人们的危害正在逐步加重，但是目前用于治疗NAFLD的药物很少，临床主要使用一些降脂药物来治疗NAFLD，如他汀类降血脂药物。虽然降脂药物可降低NAFLD患者的高血脂症状，可以延缓NAFLD的病程，但是长期服用会引发一些副作用，如肝功能损伤等。这种无药可用的情况严重阻碍了NAFLD的治疗[5]。
牛蒡(Arctium lappa L.)，为菊科牛蒡属的二年生草本植物，属于药食同源类中药，毒性极低，安全性高。在山东一些地区，人们喜欢饮用牛蒡茶(以中草药牛蒡根为原料的纯天然茶品)，具有调节血糖、健胃润肠、通经活络等功效。一些研究也发现，牛蒡具有很好的抗炎和抗氧化生物活性，但是关于牛蒡治疗NAFLD的研究尚未见报道[6] [7]。因此，本研究旨在研究牛蒡治疗NAFLD的药效，为将牛蒡用于治疗NAFLD提供依据。
2. 实验材料
2.1. 实验动物
本研究选用鼠龄6周的雄性C57BL/6小鼠构建小鼠NAFLD模型，所有实验动物均由济南市金丰实验动物繁育有限公司提供，SCXK (鲁) 2014-0006。
2.2. 实验试剂
本研究所用牛蒡根茎购自北京同仁堂公司。本研究所用生化检测试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。本研究所用HE染色试剂盒购自索莱宝生物科技有限公司。
3. 方法
3.1. 牛蒡提取物制备
取牛蒡根茎100 g，清洗干净后，加入4 L蒸馏水开始加热回流提取，提取时间2 h。弃去废渣，保留水提液，并用200目滤布过滤，获得牛蒡水提液。使用旋转蒸发仪将牛蒡水提液浓缩至50 mL，获得牛蒡提取物浓缩液。将牛蒡提取物浓缩液放入真空冷冻干燥机进行冷冻干燥处理，最终获得18.73 g牛蒡提取物粉末，提取率为18.73%。将所得牛蒡提取物粉末置于−20℃冰箱低温保存备用。
3.2. 实验分组与给药处理
50只成年雄性C57BL/6小鼠被随机分为5组：正常组、NAFLD组、低剂量牛蒡治疗组(1 mg/kg)、中剂量牛蒡治疗组(10 mg/kg)和高剂量牛蒡治疗组(100 mg/kg)。正常组：喂食正常基础饲料4周后，开始每天灌胃1 mL蒸馏水，继续喂食正常基础饲料8周。NAFLD组：喂食高脂饲料4周后，开始每天灌胃1 mL蒸馏水，继续喂食高脂饲料8周。低剂量牛蒡治疗组：喂食高脂饲料4周后，开始每天灌胃1 mg/kg牛蒡提取物，继续喂食高脂饲料8周。中剂量牛蒡治疗组：喂食高脂饲料4周后，开始每天灌胃10 mg/kg牛蒡提取物，继续喂食高脂饲料8周。高剂量牛蒡治疗组：喂食高脂饲料4周后，开始每天灌胃100 mg/kg牛蒡提取物，继续喂食高脂饲料8周。
3.3. 生化指标检测
造模12周后，摘眼球取血法采集1 mL小鼠血液，离心收集上层血清，严格按照生化检测试剂盒说明书，检测血清中AST、ALT、TG、TC和LDL-C的含量。
3.4. HE染色切片观察
采集各组小鼠肝脏组织，用生理盐水将血等污渍清理在肝脏表面，并用滤纸吸干水份。将相同部位的肝脏组织固定在4%中性甲醛中，固定时间超过24 h，用HE染色切片，各组切片观察组织坏死程度，进行病理观察。
3.5. 统计学处理
本研究数据用
± s表示，分析时使用SPSS10.0软件。用方差分析进行多组定量数据的比较，再通过纽曼–库尔斯测试进行组间比较；以p < 0.05表示具有显著性差异。
4. 结果
4.1. 牛蒡提取物降低AST和ALT含量
AST和ALT是反映肝细胞损伤的肝功能检测指标，本研究采用检测血清中AST和ALT的含量来反映牛蒡提取物对肝脏细胞损伤的影响。如表1所示，与正常组相比，NAFLD组的小鼠肝细胞出现损伤，血清中AST和ALT的含量明显升高(p < 0.01)，而10 mg/kg和100 mg/kg的牛蒡提取物均能减轻肝细胞损伤，显著降低NAFLD小鼠血清中AST和ALT含量(p < 0.01)。这一结果表明，牛蒡提取物可以缓解NAFLD小鼠对肝脏细胞的伤害。
Table 1. Arctium lappa L. reduced ALT and AST levels (n = 6,
± s)
表1. 牛蒡提取物降低ALT和AST的含量(n = 6,
± s)
组别 |
AST (U/L) |
ALT (U/L) |
正常组 |
43.55 ± 7.40 |
35.27 ± 5.73 |
NAFLD组 |
136.04 ± 18.79 ## |
119.82 ± 18.52 ## |
1 mg/kg牛蒡提取物组 |
123.35 ± 6.46 |
100.67 ± 11.66 |
10 mg/kg牛蒡提取物组 |
93.24 ± 5.68 ** |
78.01 ± 10.51 ** |
100 mg/kg牛蒡提取物组 |
77.76 ± 10.50 ** |
62.40 ± 7.72 ** |
Note: ##P < 0.01, compared to control group; **P < 0.01, compared to NAFLD group．
注：与正常组比较，##P < 0.01；与NAFLD组比较，**P < 0.01。
4.2. 牛蒡提取物减轻NAFLD小鼠肝损伤
HE染色结果表明牛蒡提取物能有效减轻NAFLD小鼠的肝脏病理损伤。结果如图1所示，正常组小鼠肝脏组织并未发生损伤，HE病理切片显示：肝细胞索排列整齐，肝细胞结构清晰，肝小叶结构清晰。NAFLD组小鼠肝脏发生严重的病理组织损伤，HE病理切片显示：中央静脉周围肝细胞索排列紊乱，胞质疏松，存在较多脂肪空泡。1 mg/kg牛蒡提取物组中小鼠肝脏组织类似于NAFLD组，同样出现严重的肝脏损伤，HE病理切片显示：肝中央静脉周围肝细胞索排列紊乱，肝血窦变窄，肝细胞肿胀，胞质疏松，并且也存在一些脂肪空泡。10 mg/kg和100 mg/kg牛蒡提取物治疗均能降低NAFLD小鼠的肝脏病理损伤，HE病理切片显示：肝小叶结构清晰，肝细胞结构清晰，浆丰核大，脂肪空泡极少。
Figure 1. HE staining results showed that Arctium lappa L. reduced NAFLD injury (n = 6)
图1. HE染色结果显示牛蒡提取物减轻NAFLD损伤(n = 6)
4.3. 牛蒡提取物改善NAFLD小鼠的脂质代谢紊乱
Table 2. Arctium lappa L. reduced the levels of TG, TC, and LDL-C in NAFLD mice (n = 6,
± s)
表2. 牛蒡提取物降低NAFLD小鼠血清中TG含量、TC含量和LDL-C含量(n = 6,
± s)
组别 |
TG (mmol/L) |
TC (mmol/L) |
LDL-C (mmol/L) |
正常组 |
0.56 ± 0.04 |
3.48 ± 0.38 |
2.85 ± 0.29 |
NAFLD组 |
0.84 ± 0.10## |
7.71 ± 0.85## |
4.99 ± 0.57## |
1 mg/kg牛蒡提取物组 |
0.81 ± 0.02 |
6.98 ± 1.20 |
4.53 ± 0.37 |
10 mg/kg牛蒡提取物组 |
0.67 ± 0.06** |
5.42 ± 0.78** |
3.60 ± 0.60** |
100 mg/kg牛蒡提取物组 |
0.61 ± 0.06** |
4.96 ± 0.47** |
3.02 ± 0.24** |
Note: ##P < 0.01, compared to control group; **P < 0.01, compared to NAFLD group．
注：与正常组比较，##P < 0.01；与NAFLD组比较，**P < 0.01。
高血脂是NAFLD的主要表现之一，本研究检测血清中TG、TC和LDL-C的含量来反映牛蒡提取物对NAFLD小鼠脂质代谢紊乱的影响。如表2，实验检测结果显示，正常组小鼠脂质代谢功能正常，血清中TG含量正常，TC含量正常，LDL-C含量正常。NAFLD组小鼠发生脂质代谢功能障碍，造成血清中TG含量升高，TC含量升高，LDL-C含量升高。10 mg/kg和100 mg/kg的牛蒡提取物能改善脂质代谢功能障碍，显著降低NAFLD小鼠血清中TG、TC和LDL-C的含量。但是1 mg/kg牛蒡提取物并不能显著降低NAFLD小鼠血清中的脂质水平。
5. 讨论
HFD被认为是引发NAFLD的主要原因之一，长期的HFD会过多增加血液中游离脂肪酸水平，从而显著增加肝脏中三酰甘油的合成，造成肝脏负荷过重，最后导致肝功能受损[8]。HFD也是目前用于构建动物NAFLD模型最常用的办法之一[9]。本研究结果发现，HFD显著增加小鼠血清中AST和ALT的水平，并且造成小鼠肝脏组织出现严重的损伤。通过牛蒡提取物治疗可以逆转NAFLD小鼠的AST和ALT升高，同时也减轻NAFLD小鼠的肝脏并组织病理损伤。这些结果说明牛蒡提取物能减轻NAFLD损伤。
脂质代谢紊乱被认为是NAFLD的发病机制之一，HFD会造成能量过剩，引发高脂血症，造成肝损伤；肝脏损伤后，肝脏对脂质的代谢能力减弱，又会加重高脂血症[10] [11]。本研究采用HFD构建的NAFLD小鼠血清中TG、TC和LDL-C的水平显著升高，而牛蒡提取物可以有效逆转这一高血脂情况。这些结果表明，牛蒡提取物可以缓解NAFLD的脂质代谢功能障碍。
综上所述，牛蒡提取物具有很好的降脂作用，并且能有效改善HFD诱导的NAFLD损伤。与西药相比较，牛蒡属于药食同源类中药，毒性极低，安全性高，可能在治疗NAFLD上具有一定的优势。
NOTES
*通讯作者。