1. 引言
传染性皮下及造血器官坏死病(Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis, IHHN)是甲壳类动物常见的病毒之一，也是世界动物卫生组织(The World Organization for Animal Health, WOAH)规定必须申报的甲壳类疾病之一[1]。其又名慢性矮小残缺综合症(Runt-Deformity Syndrome, RDS)，其病原是对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious Hypodermal and Hematopoictic Vecrosis Virus, IHHNV) [2]。IHHNV是无囊膜二十面体结构，大小为22 nm [3]，对细角滨对虾(Litopeuces srvlirostris)对IHHNV的感染性较强，死亡率高达90% [4]。对虾被IHHNV感染后，存活个体在成为病毒终生携带体的同时，还可以通过垂直传播方式把病毒传给下一代，通过水平传播方式把病毒传至其它种群[5]。
IHHNV在世界许多国家都有报道，如墨西哥、澳大利亚、新加坡、马来西亚、泰国、印度尼西亚、菲律宾、印度、韩国、巴西、阿根廷、委内瑞拉等，自2001年以来，中国沿海地区的对虾和蟹中均检测到IHHNV [6]。说明IHHNV在我国已形成了一定的流行趋势，目前仍是严重危害我国对虾养殖产业的主要病原。2014~2020年，天津机场对虾苗种监测点的检测结果显示，凡纳滨对虾苗种普遍存在携带IHHNV的情况，至2019年IHHNV检出率达到最高峰12.5%。从育苗场抽样检测的结果显示，近几年IHHNV阳性率虽然有所下降，但每年仍有检出[7]。邓威等发现2015~2016年天津市对虾养殖主产区已普遍存在IHHNV感染[8]。
目前IHHNV的诊断技术主要有组织学检测和分子生物学诊断。组织学检测具体是指通过对病理组织制作切片，再对组织切片中的特定的组织成分进行原位的定性、定位或定量研究。组织学检测方法虽然具有成本优势，但在操作上繁琐，并且检测的时间长，所需试剂多，不适用诊断。分子诊断技术是从分子的水平，利用分子扩增的原理将少量的病原体的特定基因组进行扩增，并通过检测手段进行检测。其应用在IHHNV的诊断上目前有两种，即基于PCR分子检测方法和等温扩增检测方法，该类方法具有高灵敏性和特异性强等特点[9]。TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR在检测的灵敏度、速度和检出率上均优于常规PCR [10]。WOAH推荐的IHHNV检测方法为普通PCR方法和荧光定量PCR方法，我国现行针对该病的国家标准也只推荐了普通PCR的检测方法[11]。但徐丽美等通过研究发现了每毫克组织含103个病毒粒子可作为传染性皮下及造血器官坏死病暴发的危险临界数值[12]，张娜等发现养殖过程中进行有效的生物安保措施是预防对虾传染性皮下及造血组织坏死病的最有效的方法，而该病无有效的治疗方法[13]。因此，用一种灵敏、快速的IHHNV检测方法进行IHHNV的准确定量，可以在养殖生产上为防控该病的大面积爆发提供必要的数据支持。本研究利用天津地区IHHNV毒株，建立了IHHNV的TaqMan MGB定量检测方法，完成了反应体系的优化，检测方法的特异性、重复性、灵敏度等多项指标的评价，为该病原的准确定量提供技术支撑。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 实验病虾来源
患病的凡纳滨对虾采集于天津滨海新区某养殖场，经IHHNV国标方法[14]检测并测序后，确定为IHHNV阳性对虾病料，取其肝胰腺和鳃丝组织，于−80℃保存。后续用于特异性实验的健康对虾核酸样本以及携带对虾白斑病、高致病性副溶血弧菌、虾肝肠胞虫病、虹彩病毒病的核酸样本均由本实验室保存。
2.1.2. 主要设备和试剂
主要仪器：荧光定量PCR仪(ABI)，PCR仪(ABI)、凝胶成像系统(Biometra)、金属浴(天根生物)、离心机(Sigma)、电泳仪(北京六一)。
试剂：海洋动物组织基因组提取试剂盒DNA (天根生化科技有限公司)，质粒提取试剂盒均购自大连宝生物(TakaRa)，本文所用引物均由TaKara合成。
2.2. 方法
2.2.1. 引物探针的设计
根据GenBank中已登录的IHHNV基因序列(GenBank登录号：AF218226)为靶基因，使用PrimerExpress软件按照引物设计原理，设计并筛选出1对引物和1条TaqMam MGB探针(表1)。
Table 1. Primer and probe sequences for IHHNV
表1. IHHNV引物和探针序列
引物和探针 |
序列(5’~3’) |
长度(nt) |
产物大小(bp) |
F |
GGCCTAGTAACAAGAACAGGAG |
22 |
|
R |
CTGTTATTTGACTGATTCTGGGTTC |
25 |
103 |
P |
AGAGCGTAGGACTTTCCGATGAGGT |
25 |
|
2.2.2. 阳性质粒的构建
将感染IHHNV的对虾鳃丝组织采用基因组提取试剂盒进行DNA提取，以提取的基因组作为PCR反应模版，使用IHHNV质粒扩增引物(表2)进行PCR扩增，其中反应体系(总体积25 μl)为：上游引物F1 (10 μmol) 0.75 μl、下游引物R1 (10 μmol) 0.75 μl、模板0.5 μl、2 × Premix Taq buffer 12.5 μl、Taq DNA聚合酶(5 U/μl) 0.25 μl、DEPC水10.25 μl。反应条件为：95℃ 5 min、95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 7 min，4℃保存。所得PCR产物经回收后与pMD18载体连接，以构建重组IHHNV质粒pMD-18-IHHNV，作为阳性质粒。将重组对虾pMD-18-IHHNV质粒转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞，构建对虾IHHNV重组大肠杆菌pMD-18-IHHNV-TOP10株，并对重组菌株进行了测序与鉴定。
Table 2. Primer sequences for IHHNV
表2. IHHNV质粒扩增引物序列
引物 |
序列(5’~3’) |
长度(nt) |
产物大小(bp) |
F1 |
ATCGGTGCACTACTCGGA |
18 |
|
R1 |
TCGTACTGGCTGTTCATC |
18 |
356 |
2.2.3. IHHNV荧光定量PCR扩增体系的优化
使用1.2.1步骤中设计的引物与探针，以1.2.2构建的IHHNV质粒为模板，进行荧光定量PCR扩增优化实验。对引物、探针、模板等浓度、退火温度、扩增循环数等条件进行了优化和摸索，最终确定反应体系为：上游引物F (10 μmol) 1.5 μL；下游引物R (10 μmol) 1.75 μL；探针P (10 μmol) 1.5 μL；模板2 μL；2 × Probe PCR buffer Mix 12.5 μL；DEPC水5.75 μL，总体积为25 μL。扩增反应条件为：94℃预变性10 s；94℃变性5 s，60℃退火20 s；共40个循环，在每一循环退火结束时收集荧光信号。
2.2.4. IHHNV荧光定量PCR检测标准曲线的建立
参照质粒提取试剂盒说明书，提取pMD-18-IHHNV质粒，扩增片段大小为356 bp。用超微量分光光度计测定质粒DNA的浓度并根据公式：重组质粒拷贝数(copies/μl) = (质粒浓度 × 10−9 × 6. 02 × 1023) /(660道尔顿/碱基 × 碱基数) [15]，使用Easy dilution (TaKara)将重组IHHNV质粒pMD-18-IHHNV进行10倍梯度稀释(1 × 108 copies/μl – 1 × 101 copies/μl)，以8个浓度梯度的重组质粒作为建立标准曲线的模板，进行荧光定量PCR扩增，所用引物探针、扩增反应体系及反应条件均与步骤1.2.3相同。上述9个浓度梯度，每个浓度重复3次，取3次的均值，以循环数为横坐标，荧光强度的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。
2.2.5. 灵敏度评价
采用了Easy Dilution (TaKara)将重组IHHNV质粒pMD-18-IHHNV进行梯度稀释，稀释后的质粒作为检验该荧光定量方法灵敏度的评价模板，进行PCR扩增，所用引物探针、扩增反应体系及反应条件均与步骤1.2.3相同。
2.2.6. 特异性评价
采用1.2.3的IHHNV荧光定量PCR检测方法对对虾传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、对虾白斑综合症病毒(WSSV)、对虾肝肠胞虫(EHP)、对虾虹彩病毒(DIV)、高致病性副溶血弧菌(AHPND)进行检测，用于评价该方法区别鉴定对虾传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)与其它对虾常见几种重大疫病病原的特异性。
2.2.7. 重复性评价
以重组IHHNV质粒pMD-18-IHHNV浓度为1 × 107 copies/μl、1 × 106 copies/μl 、1 × 105 copies/μl为模板，采用1.2.3中IHHNV荧光定量PCR检测方法进行重复性试验。每个模版分别进行3次重复检测，记录Ct值，统计并计算变异系数，变异系数(CV) = 标准偏差(SD)/平均值(MN)。
2.2.8. 临床样品的检测应用
从本市滨海新区随机抽取3家对虾养殖场的20份对虾样品，采用本研究建立的IHHNV荧光定量检测方法进行检测，同时采用国标法进行验证和确认。
3. 结果与分析
3.1. 标准曲线的绘制
绘制的标准曲线如图1所示，得到的相关系数R2 = 0.9995，方程式为y = −0.3084X + 12.631，从图3可以看出，1 × 108 copies/μl~1 × 101 copies/μl浓度的PCR扩增曲线均有效。
Figure 1. Standard curve established for IHHNV fluorescence quantitative PCR detection method
图1. IHHNV荧光定量PCR检测方法建立的标准曲线
3.2. 灵敏度评价结果
Figure 2. Sensitivity detection results of IHHNV real-time fluorescence quantitative PCR detection method. Among them, 1~10 are 1 × 108 copies/μl, 1 × 107 copies/μl, 1 × 106 copies/μl, 1 × 105 copies/μl, 1 × 104 copies/μl, 1 × 103 copies/μl, 1 × 102 copies/μl, 1 × 101 copies/μl, 5 copies/μl, 1 copy/μl, and 11 are negative control samples
图2. IHHNV实时荧光定量PCR检测方法灵敏度检测结果图，其中1~10分别为1 × 108 copies/μl、1 × 107 copies/μl、1 × 106 copies/μl、1 × 105 copies/μl、1 × 104 copies/μl、1 × 103 copies/μl、1 × 102 copies/μl、1 × 101 copies/μl、5 copies/μl、1 copies/μl，11为阴性对照品
灵敏度评价结果如图2所示，本研究建立的检测方法对重组对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒质粒pMD-18-IHHNV的最低检出限为5 copies/μl。
3.3. 特异性评价结果
特异性检测结果如图3所示，除对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒外，其他病原(菌)均未出现有效扩增曲线，表明该检测方法在检测鉴定对虾常见几种病原间具有良好的特异性。
Figure 3. Specific detection results of IHHNV real-time fluorescence quantitative PCR detection method. Among them, 1 is a positive quality control, 2~5 are respectively shrimp white spot syndrome virus, shrimp highly pathogenic Vibrio parahaemolyticus, shrimp rainbow virus, shrimp hepatointestinal parasite, and 6 is a negative control substance
图3. IHHNV实时荧光定量PCR检测方法特异性检测结果，其中1为阳性质控，2~5分别为对虾白斑综合症病毒、对虾高致病性副溶血弧菌、对虾虹彩病毒、虾肝肠胞虫，6为阴性对照品
3.4. 重复性评价结果
从表3的结果可以看出，不同浓度标准品组内的变异系数(CV)在0.08%~0.26%之间，表明该方法具有较好的重复性。
Table 3. Results of repeatability evaluation analysis of IHHNV fluorescence quantitative detection method
表3. IHHNV荧光定量检测方法重复性评价分析结果
标准品浓度 |
CT值 |
平均值X ± SD |
变异系数% CV |
105 copies/μl |
27.95、28.03、28.28 |
28.09 ± 0.030 |
0.11% |
106 copies/μl |
20.83、20.71、20.58 |
20.71 ± 0.016 |
0.08% |
107 copies/μl |
18.86、18.95、18.53 |
18.78 ± 0.049 |
0.26% |
3.5. 临床样品检测结果的比较
用常规PCR方法和本试验方法对20份临床样品进行检测，结果如表4显示常规PCR方法检测样品阳性率为25% (5/20)，本试验方法检测样品阳性率为30% (6/20)，其中5份与常规方法检测结果一致，1份为同批次出现阳性样品养殖场样品，荧光定量检测CT值为34.78，说明本文建立的IHHNV荧光定量检测方法与传统PCR方法相比较，灵敏度更高，可以降低对虾IHHNV的漏检率。
Table 4. The results of clinical sample detection
表4. 临床样品检测结果
指标 |
PCR |
荧光定量PCR |
阳性 |
5 |
6 |
可疑 |
0 |
2 |
阴性(荧光定量ct值 ≥ 38) |
15 |
12 |
共计 |
20 |
20 |
4. 讨论
对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒是已知对虾病毒中最小的病毒[16]，于1981年首次发现，现广泛分布于全球各种野生和养殖对虾中[3]。Yang等通过对中国沿海的对虾和蟹类样品的IHHNV检测，证实自2001年起中国已有IHHNV的流行[17]。从2014年~2020年天津凡纳滨对虾育苗场抽样检测IHHNV的结果来看，每年都有检出，至2020年检出率达到19.51%，因此对于IHHNV防控，检测结果的快速准确尤为重要[7]。实时荧光定量PCR被认为是目前最敏感、特异性、重复性最好的核酸定性、定量检测方法[18]。根据信号基团的不同，实时荧光定量PCR可以分为染料法和探针法，探针法中使用的探针多是TaqMan探针，与染料法相比，在一定程度上避免了假阳性问题的出现[19]。
本试验根据IHHNV基因组的保守序列，设计了Taq Man-MGB探针，并对反应条件中引物浓度、探针浓度等条件进行优化，确定了该荧光定量PCR的最佳反应体系，建立了TaqMan MGB探针荧光定量PCR检测IHHNV的方法。本实验以pMD18-T-IHHNV重组质粒为标准品，绘制了标准曲线。本试验通过大量样品的检测结果表明，该方法检IHHNV的灵敏度高，约为5个病毒粒子/反应，在1 × 101~1 × 108拷贝/ul的范围内具有良好的线性关系，定量范围宽，特异性、重复性好。本方法简便快速，从样品制备到获得检测结果仅需3 h~4 h，适合于该病原的快速定量检测，为对虾IHHNV在生产上早诊断，早预防提供了技术方法。
5. 结论
本研究建立的对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) TaqMan MGB检测方法具有反应速度快、特异性强、灵敏度高等优点。该方法采用构建的重组质粒作为阳性标准品，在对反应条件和反应温度优化后，灵敏度达到了5 copies /μl，能够完成对IHHNV的快速定量检测，为对虾IHHNV在生产上的检测及防控提供了有效的技术手段。
项目基金
天津市农业发展服务中心种业青年科技创新项目“凡纳滨对虾新品种‘海兴农3号’的引进与养殖技术研究”，项目编号：zxkj202422。
天津市农业产学研“揭榜挂帅”关键技术集成攻关类项目“南美白对虾池塘高密度养殖疫病防控技术的集成应用”，项目编号：GBGG202301。
天津市科技计划项目“盐碱水凡纳滨对虾养殖与病害防控技术示范与应用”，项目编号：22ZXBTSN00080。
NOTES
*通讯作者。