1. 引言

全球变暖如今是当今世界面临的一大问题之一，全球变暖被认为的主要原因是大气中的二氧化碳(CO₂)、甲烷(CH₄)、氧化亚氮(N₂O)等温室气体浓度不断增加[1]。而甲烷的温室效应是二氧化碳的20~30倍[2]，自人类进入工业化时代以来，甲烷对全球变暖的贡献高达20%，仅次于二氧化碳[3]。湖泊是大气CH₄的重要释放源，据估计全球湖泊CH₄释放量为8~48 Tg/yr，为自然源CH₄释放总量的6%~16% [4]，在湖泊背景下研究甲烷减排对全球碳氮循环及减缓全球变暖具有重要意义。湖泊甲烷的排放是产生、氧化和传输三个过程的净结果，因此减少甲烷气体排放的途径主要是从抑制甲烷产生和促进甲烷氧化2个方面着手。CH₄的氧化是将CH₄的电子传递到电子受体(氧化剂)的过程。自然界中，CH₄的氧化途径主要分为两种类型：一种是微生物在有氧的条件下利用O₂作为电子受体的甲烷好氧氧化过程(Aerobic methane oxidation, AMO)；另一种是微生物在厌氧的条件下用O₂以外的其它电子受体(如： ${\text{NO}}_3^{-}$ 、 ${\text{NO}}_2^{-}$ 、 ${\text{SO}}_4^{2-}$ 等)的甲烷厌氧氧化过程(Anaerobic methane oxidation, AOM) [5]。有关甲烷氧化的研究最先集中于甲烷的好氧氧化，相关的环境因素及微生物特性的研究也已较为完善和深入。长期以来，人们认为甲烷好氧氧化是甲烷代谢的唯一途径，直到1974年，有研究者在海洋沉积物中发现硫酸盐还原耦合甲烷的厌氧氧化[6]，改变了以往对CH₄仅存在好氧氧化过程的认识。已有学者证明，甲烷厌氧氧化约削减了海洋底层甲烷通量的90%以上[7]，削减了淡水湿地排放的50 %以上[8]，这样使得进入大气的甲烷大量减少。根据电子受体的不同，甲烷厌氧氧化可分为四类：(1) 以 ${\text{SO}}_4^{2-}$ 作为最终电子受体，被称为硫酸盐还原型甲烷厌氧氧化(Sulphate-reduction-dependent aerobic methane oxidation, SAMO)；(2) 以 ${\text{NO}}_3^{-}$ 、 ${\text{NO}}_2^{-}$ 作为最终电子受体，被称为反硝化型甲烷厌氧氧化(Denitrification-dependent anaerobic methane oxidation, DAMO)；(3) 以Fe、Mn作为最终电子受体，被称为金属型依赖型甲烷厌氧氧化；(4) 以HA腐殖酸(humicacids, HA)、AQDS (蒽醌-2,6-二磺酸盐)为电子受体的有机电子受体型甲烷厌氧氧化。甲烷厌氧氧化是地球碳循环重要的一部分，对于维持全球气候起到了重要的作用。

湖泊是地球生态系统的重要组成部分，对湖泊中甲烷厌氧氧化电子受体的研究可以加深对湖泊生态系统中碳、氮、硫、铁等元素生物地球化学循环的理解。不同的电子受体参与甲烷厌氧氧化过程，使得甲烷的氧化与其他元素的循环紧密耦合，揭示了生态系统中物质循环的复杂性和相互关联性，为生物地球化学理论的发展提供了重要的支撑。

2. 以 $S{O}_4^{2-}$ 为最终电子受体的硫酸盐还原型甲烷厌氧氧化(SAMO)

以 ${\text{SO}}_4^{2-}$ 作为电子受体的甲烷厌氧氧化是最早被发现的。1976年Reeburgh等人首次在海洋沉积物中发现中存在甲烷和硫酸盐的共代谢现象，甲烷从深层沉积物逐渐向上扩散至硫酸盐还原层而非含氧表层沉积物时，存在被消耗的情况。这一发现使人们对甲烷氧化的现象不再局限于有氧氧化[6]。同时也有人提出了甲烷和硫酸盐耦合的反应式[9]：

${\text{CH}}_4+{\text{SO}}_4^{2-}\to {\text{HCO}}_3^{-}+{\text{HS}}^{-}+{\text{H}}_2\text{O}\left(\Delta G^{\theta ’}=-16\text{ kJ}\cdot {\text{mol}}^{-1}{\text{ CH}}_4\right)$ (1)

上述反应的吉布斯自由能较低(ΔG^θ’ = −16 kJ·mol⁻¹ CH4)，但由于在硫酸盐–甲烷转换带(Sulfate methane transition zone, SMTZ)富含甲烷和硫酸盐，所以SMTZ给SAMO提供了良好的反应环境，因此SAMO的发生较为普遍。除了海洋沉积物外，SAMO的发生场所也较为普遍，已有学者证明在稻田湿地[10]、垃圾堆埋区[11]、天然淡水区[12]均能发生。

在硫酸盐型甲烷厌氧氧化过程的微生物包含硫酸盐还原细菌(SRB)和甲烷厌氧氧化古菌(ANME)。这两种菌体一般是以聚和体的形式存在[13]，并且在空间上有着紧密耦合联系[14]。通过参与SAMO反应的甲烷厌氧氧化古菌(ANME)根据系统发育分析，可以分为三类：ANME-1、ANME-2、ANME-3，均属于广古菌门。SAMO系统中的SRB一般属于脱硫八叠球菌(Desulfosarcina)，典型形状为球状、短杆状、弧状[15]。

目前，已有三种理论途径用于解释以硫酸盐为电子受体的反应机理，即：反向产甲烷理论、乙酸化理论以及甲基化理论[16]。其中，反向产甲烷理论是最先被提出的，同时也是被研究最多的理论。其反应原理为H₂O得到CH₄所释放的电子后还原为H₂，然后H₂被硫酸盐还原细菌(Sulfate-reducing bacteria, SRB)利用[17]-[19]。

${\text{CH}}_4+2{\text{H}}_2\text{O}\to {\text{CO}}_2+4{\text{H}}_2$ (2)

${\text{SO}}_4^{2-}+4{\text{H}}_2+{\text{H}}^{+}\to {\text{HS}}^{-}+4{\text{H}}_2\text{O}$ (3)

乙酸化理论认为(Anaerobic methanotrophic archaea, ANME)甲烷氧化生成氢和乙酸，被硫酸盐还原细菌利用与被硫酸盐还原过程耦合。此途径包括两种：(1) ANME利用CH₄进行氧化产出H₂和乙酸，SRB利用乙酸将 ${\text{SO}}_4^{2-}$ 还原为 ${\text{HS}}^{-}$ 和(2) ANME和CO₂把CH₄氧化为乙酸，SRB利用乙酸生成 ${\text{HCO}}_3^{-}$ 、 ${\text{HS}}^{-}$ [18] [20]。而甲基化理论认为甲烷氧化菌利用CH₄和 ${\text{HS}}^{-}$ 生成甲硫醚(CH₃SH)，CH₃SH被脱硫菌利用，生成 ${\text{HCO}}_3^{-}$ 、 ${\text{HS}}^{-}$ [21] [22]。

${\text{2CH}}_4+{\text{SO}}_4^{2-}\to 2{\text{HCO}}_3^{-}+{\text{HS}}^{-}+2{\text{H}}_2\text{O}$ (4)

${\text{CH}}_4+{\text{HCO}}_3^{-}\to {\text{CH}}_3{\text{COO}}^{-}+{\text{H}}_2\text{O}$ (5)

${\text{CH}}_3{\text{COO}}^{-}+{\text{SO}}_4^{2-}\to {\text{HCO}}_3^{-}+{\text{HS}}^{-}$ (6)

$3{\text{CH}}_4+{\text{HCO}}_3^{-}+5{\text{H}}^{+}+4{\text{HS}}^{-}\to {\text{CH}}_3\text{SH}+{\text{3H}}_2\text{O}$ (7)

$4{\text{CH}}_3\text{SH}+{\text{3SO}}_4^{2-}\to 4{\text{HCO}}_3^{-}+7{\text{HS}}^{-}+5{\text{H}}^{+}$ (8)

此外，有学者表明以单质S作为中间产物的SAMO机理是一个新途径[23]。该途径是由ANME的一类古菌(ANME-2)在没有SRB反应下，以单质S作为中间产物，ANME氧化CH₄为CO₂， ${\text{SO}}_4^{2-}$ 利用其中产生的电子在细胞中产生中间产物S，并排出细胞外与硫化物反应为二硫化物[24]，证明了ANME与SRB在一定条件下可以独自生存，AOM可以由ANME独自完成。虽然其中S元素的酶催化机制尚不明确，但是从一个新的角度说明了ANME与SRB的功能，打开研究方向。

3. 以 $N{O}_3^{-}$ 、 $N{O}_2^{-}$ 为最终电子受体的反硝化型甲烷厌氧氧化(NAMO)

以硝酸盐( ${\text{NO}}_3^{-}$ )或亚硝酸盐( ${\text{NO}}_2^{-}$ )为电子受体的AOM (DAMO)研究开展相对SAMO较晚。在1977年，有学者根据热力学化学反应推测 ${\text{NO}}_3^{-}$ / ${\text{NO}}_2^{-}$ 作为电子受体比 ${\text{SO}}_4^{2-}$ 吉布斯自由能更低，因此更有优势推进厌氧甲烷氧化，且在淡水水体中硝酸盐浓度远大于硫酸盐浓度，DAMO可能更容易发生[25]。

$5{\text{CH}}_4+{\text{8NO}}_3^{-}+8{\text{H}}^{+}\to 5{\text{CO}}_2+4{\text{N}}_2+14{\text{H}}_2\text{O}\left(\Delta G\theta ’=-765\text{ kJ}\cdot {\text{mol}}^{-1}{\text{ CH}}_4\right)$ (9)

$3{\text{CH}}_4+{\text{8NO}}_2^{-}+8{\text{H}}^{+}\to 3{\text{CO}}_2+4{\text{N}}_2+10{\text{H}}_2\text{O}\left(\Delta G\theta ’=-928\text{ kJ}\cdot {\text{mol}}^{-1}{\text{ CH}}_4\right)$ (10)

一直没有数据支撑这个论点，直到2006年，Rachoebarsing等人在淡水运河底泥富集培养物首次证实了甲烷厌氧氧化耦合反硝化过程[26]，CH₄的减少可能是由微生物介导CH₄厌氧消耗所造成的。DAMO分布较为广泛，研究者相继在长江河口沉积物[27]，德国康斯坦茨湖[28]，黄河三角洲滨海湿地[29]，荷兰污水处理厂[30]，西湖底泥与农田水稻土壤[31]中都证实了存在DAMO。

参与DAMO的主要功能微生物为以 ${\text{NO}}_3^{-}$ 为电子受体甲烷厌氧氧化古菌ANME-2d和以 ${\text{NO}}_2^{-}$ 为电子受体M. oxyfera类细菌(隶属于NC10门) [32]。氮依赖型甲烷厌氧氧化过程通常以 ${\text{NO}}_3^{-}$ / ${\text{NO}}_2^{-}$ 为电子受体，CH₄为电子供体，在微生物的作用下将CH₄氧化CO₂， ${\text{NO}}_3^{-}$ / ${\text{NO}}_2^{-}$ 还原为N2在，在厌氧条件下，ANME-2d古菌与NC10细菌“念珠菌甲基单胞菌”(M. oxyfera)可以形成一种协同共存关系[33]，优先利用 ${\text{NO}}_2^{-}$ 。以硝酸盐为电子受体氧化甲烷的微生物只有属于厌氧甲烷营养古菌群的念珠菌甲烷还原菌(M.nitroreducens)，属于ANME-2d分支，NC10细菌只能利用亚硝酸盐，不能利用硝酸盐[33]。ANME-2d古菌则能够利用CH₄为电子供体将硝酸盐转化为亚硝酸盐，一部分亚硝酸盐被NC10细菌等专用亚硝酸盐的微生物以及厌氧氨氧化细菌还原为氮气[34]，另一部分ANME-2d古菌编码的膜结合亚硝酸盐还原酶进一步还原为铵[35]，铵又能再次被氨氧化古菌/细菌利用。

近来，通过同位素示踪技术发现M. oxyfera细菌能利用一种新型的内部产氧机制驱动甲烷在厌氧条件下的氧化。Ettwig等在2010年提出M. oxyfera细菌催化DAMO过程的理论模型。即 ${\text{NO}}_2^{-}$ 在亚硝酸盐还原酶(Nir)的作用下还原成一氧化氮(NO)，然后NO被歧化酶分解为N₂和O₂，其中一部分O₂用于甲烷好氧氧化最终生成CO₂ [32]。2011年Wu等人进一步提出了M. oxyfera细菌的分解代谢、能量代谢途径[36]，并在此基础上通过免疫金标记试验，甲烷单加氧酶和亚硝酸盐还原酶两者同时存在于M. oxyfera细胞内，再次证实此细菌可单独进行甲烷厌氧氧化过程[37]。2016年Ananda利用M. oxyfera细菌和含有nod-like基因的微生物的宏基因组文库，设计出了nod基因靶向引物。使nod基因作为标记物追踪DAMO现象成为可能[38]。

N₂O作为一种电子受体驱动甲烷厌氧氧化在热力学上可行的，基于吉布斯自由能(ΔG^θ’ = −1232 kJ·mol⁻¹ CH₄)，N₂O还原耦合CH4氧化理论上是比 ${\text{NO}}_3^{-}$ 、 ${\text{NO}}_2^{-}$ 更容易发生的。

${\text{CH}}_4+{\text{4N}}_2\text{O}\to {\text{CO}}_2+4{\text{N}}_2+2{\text{H}}_2\text{O}\left(\Delta G^{\theta ’}=-1232\text{ kJ}\cdot {\text{mol}}^{-1}{\text{ CH}}_4\right)$ (11)

它可能是由未知的甲烷营养型微生物对CH₄进行好氧氧化，然后再通过内需氧甲烷氧化来实现。Cheng等人在淡水系统中利用同位素示踪的方法，首次提出在沉积物中存在CH4和N₂O生物转化的耦合现象[39]。汪方圆等人在以滨海围垦稻田湿地和南京稻田湿地为研究对象，采用¹³C标记的甲烷的方法，添加不同电子受体进行厌氧培养实验，N₂O也可以作为电子受体驱动两种土壤进行AOM，证实发生了N₂O型甲烷厌氧氧化过程[40]。Zhang等人对稻田土进行研究，水稻土中存在N₂O介导的AOM，电子穿梭反应促进AOM与N₂O还原的耦合[41]。N₂O电子受体驱动甲烷厌氧氧化甲烷厌氧氧化与同时消耗N₂O是近年来研究的热点，但其耦合机理尚不清楚。

4. 以Fe、Mn离子为最终电子受体的金属型甲烷厌氧氧化(Metal-AOM)

Fe³⁺、Mn⁴⁺、Cr⁵⁺等金属离子是除了 ${\text{SO}}_4^{2-}$ 与 ${\text{NO}}_3^{-}$ / ${\text{NO}}_2^{-}$ 外第三类参与AOM过程的电子受体。热力学角度分析发现铁锰矿物比硫酸盐更易驱动甲烷的厌氧氧化。其方程式为[42]：

${\text{CH}}_4+\text{8Fe}{\left(\text{OH}\right)}_3+15{\text{H}}^{+}\to {\text{HCO}}_3^{-}+8{\text{Fe}}^{2+}+21{\text{H}}_2\text{O}\left(\Delta G^{\theta ’}=-572.15\text{ kJ}\cdot {\text{mol}}^{-1}{\text{ CH}}_4\right)$ (12)

${\text{CH}}_4+{\text{4MnO}}_2+7{\text{H}}^{+}\to {\text{HCO}}_3^{-}+4{\text{Mn}}^{2+}+5{\text{H}}_2\text{O}\left(\Delta G^{\theta ’}=-789.91\text{ kJ}\cdot {\text{mol}}^{-1}{\text{ CH}}_4\right)$ (13)

在1980年，关于测铁、锰氧化物还原偶联甲烷氧化已有推测可能存在锰还原偶联甲烷氧化[43]，直到2009年Beal等在Eel RiverBasin发现了AOM过程微生物能够使用Mn⁴⁺和Fe³⁺所为电子受体，湖底沉积物中发现了微生物可以在不存在硫酸盐的情况下利用Mn⁴⁺和Fe³⁺作为电子受体对甲烷进行厌氧氧化，即甲烷氧化分别耦联Mn⁴⁺和Fe³⁺的还原作用[44]。之后，Metal-AMO过程也得到了一些验证。王维奇在闽江河口盐淡水环境条件下利用同位素技术得出Fe³⁺是控制闽江河口盐淡水环境条件下的湿地甲烷厌氧氧化的关键电子受体[45]，Dan Luo等人在水稻土中加入电子受体三价铁和硝酸盐以及作为电子穿梭体的生物炭，将¹³C标记的CH₄(¹³CH₄)加入到厌氧微宇宙中，通过测量甲烷氧化速率和¹³C标记的CO₂(¹³CO₂)的富集来评估电子受体的作用除了硝酸盐外，发现三价铁也能有效地促进水稻土中的AOM [46]。王子豪等以黄河三角洲滨海湿地为研究对象，通过室内厌氧培养及高通量测序方法，研究碱蓬盐沼湿地下甲烷厌氧氧化潜力及微生物群落对Fe³⁺、Mn⁴⁺输入的响应，向土壤输入不同浓度的Fe³⁺、Mn⁴⁺后，浅层土的AOM潜力皆被抑制，深层土的AOM潜力则受到促进作用，且作用显著，说明不同土层对铁、锰输入的响应不同。Fe³⁺含量较高的环境容易产生能够影响微生物和土壤酶活性的胡敏酸和较低的氧化还原电位环境，影响CH₄氧化过程，从而产生抑制作用[47]。李媛媛等以锰矿湿地污泥和自然混合污泥作为接种物，以天然锰粉和人工合成δ-MnO₂为电子受体富集锰矿物驱动的甲烷厌氧氧化微生物，并结合¹³CH₄稳定同位素示踪、高通量测序等方法，以δ-MnO₂为电子受体的体系甲烷厌氧氧化效果高于以天然锰矿粉为电子受体[48]。

至今研究认为参与Metal-AOM的功能微生物主要是隶属于ANME类群。有研究认为ANMEs不同的分支均可以直接参与金属型甲烷厌氧氧化[49]，例如：ANME-2的亚类ANME-2a、ANME-2c、ANME-2d等。在台湾地区东部陆地泥火山孔隙水研究Metal-AOM，认为ANME-1-ANME-3在内的几乎所有ANME的亚类共同参与Metal-AOM过程[50]。

对于Metal-AOM的反应机理根据目前研究所得可能的机制有三种：(1) 一种或几种微生物直接耦合CH₄，然后甲烷产生的电子直接传递给金属离子[51]。(2) ANMEs和金属还原微生物(Metal-reducing microorganism, MRM)共同作用，一起参与甲烷厌氧氧化过程。这个过程与SAMO类似[52]。(3) 微生物通过反向产甲烷的途径产生过量的H₂，H₂和Fe³⁺发生氧化还原反应[53]。

近些年，在金属依赖型厌氧甲烷在氧化机制乃至胞外电子传递，但关于等功能微生物的种群分类、细胞形态方面仍有太多未解决的问题。

5. 以HA、AQDS为电子受体的有机电子受体型甲烷厌氧氧化

除了上述几种电子受体外，有机电子也参与了驱动AOM的氧化还原过程。例如：腐殖酸(HA)和人工有机电子受体AQDS (蒽醌-2,6-二磺酸盐)。Blodau和Deppe在沼泽泥炭中证明HA和腐殖质积极参与了驱动AOM过程[54]。汪方圆等在滨海围垦稻田湿地和南京稻田湿地有机电子受体AQDS (蒽醌-2,6-二磺酸盐)、MV (甲基紫精)不但可以充当终端电子受体驱动甲烷厌氧氧化过程，而且能作为电子传递体促进甲烷厌氧氧化与N₂O还原的耦合过程[40]。Zhang等在水稻土中表明AQDS (蒽醌-2,6-二磺酸盐)和MV (甲基紫精)显著增强了N₂O介导的AOM [41]。冯婕妮等表明EDTA (金属螯合剂)和HA对Fe-AOM过程都具有一定程度的促进作用，且EDTA优于HA，甲烷氧化活性是后者的1.2倍。且添加HA (有机质)可以刺激Fe-AOM作用，使得微生物活性增长1.4倍[55]。但是，目前有机物质作为驱动AOM的电子受体的具体作用尚不清楚，还需要进一步的研究。

6. 总结

CH₄是大气中仅次于CO₂的重要温室气体，而湖泊是大气CH₄的重要释放源。在沉积物中CH₄的产生和氧化极大影响了湖泊CH₄的循环和释放，是湖泊碳循环的重要组成部分。而这个过程中AOM在控制甲烷排放过程中起着重要作用。本文则阐述了关于甲烷厌氧氧化的四种机制，国内外学者在甲烷排放通量及排放规律、甲烷氧化机制等方面，尤其是甲烷好氧氧化已经展开了较为成熟的研究。相对有氧氧化而言，AOM研究相对较晚，现阶段关于厌氧氧化电子受体的AOM研究正逐渐增多，其对湿地甲烷排放的影响及驱动机制的研究已经取得很大进展。其中以 ${\text{SO}}_4^{2-}$ 、 ${\text{NO}}_3^{-}$ / ${\text{NO}}_2^{-}$ 作为最终电子受体的AOM基本机理过程已经相对明确，在硫酸盐型甲烷厌氧氧化过程的微生物包含SRB和ANME， ${\text{NO}}_3^{-}$ 驱动型AOM为反向产甲烷途径，主要相关微生物为M. nitroreducens； ${\text{NO}}_2^{-}$ 驱动型AOM为内需氧型甲烷氧化途径，主要相关微生物为M. oxyfera。以N₂O作为一种电子受体反应研究仍处于初级探索阶段，关于其机理代谢途径及相关微生物未来需要进行更多的研究。

7. 展望

近些年在金属依赖型甲烷厌氧氧化也取得了一些进展，在厌氧甲烷微生物、氧化机制、电子传递方式等方面取得成就，但总体上金属型依赖性甲烷厌氧氧化仍有很多尚未解决的问题，厌氧甲烷微生物缺乏深入研究，也没有从分子水平探究甲烷营养古菌胞外电子传递机制。目前有机物质作为AOM的电子受体的具体作用尚不清楚。有研究证明腐殖质可作为由ANME-2d驱动的AOM的直接电子受体[56]，或通过其它的电子受体再氧化而作为电子传递体驱动AOM [57]，然而有机电子受体耦合AOM的过程还需要进一步的研究。目前的研究仍无法全面剖析甲烷氧化机理，许多问题还有待进一步研究。

参考文献