摘要: 目的：通过对肺结核患者进行异烟肼血药浓度监测，以及NAT2基因多态性检测，探讨NAT2基因多态性与异烟肼血药浓度之间的关系。方法：研究对象为昆明市第三人民医院2020年结核科诊断为初治肺结核的患者，共纳入62例，规律口服异烟肼5天，用药后2 h采外周静脉血检测其血药浓度，同时提取DNA，用Sanger法进行NAT2基因多态性分析；SPSS 22 Pearson相关性分析影响异烟肼血药浓度的因素(包括性别、年龄、体重、NAT2基因多态性)。结果：性别、年龄、体重与异烟肼血药浓度不具有相关性，而NAT2代谢型异烟肼血药浓度具有相关性；62例患者中，NAT2快代谢型22例(35.5%)，中间代谢型29例(46.8%)，慢代谢型11例(17.7%)；11例慢代谢型患者中，NAT2*6A*6A有6例，占比54.5%，NAT2*7B*7B有4例，占比36.4%，NAT2*5B*5B有1例，占比9.1%。Pearson相关性分析提示，NAT2基因多态性与异烟肼血药浓度具有相关性，P = 0.03。结论：NAT2*6A*6A与NAT2*7B*7B基因型可能为主要的NAT2慢代谢型，携带该等位基因的患者易导致异烟肼血药浓度偏高；NAT2基因多态性与异烟肼血药浓度具有相关性。NAT2基因多态性是影响异烟肼血药浓度的重要因素之一，临床在使用异烟肼时可根据NAT2基因多态性调整用药剂量，同时监测其血药浓度以达到更精准的治疗方案。
Abstract: Objective: The relationship between NAT2 gene polymorphism and isoniazid drug concentration in blood was investigated by monitoring isoniazid drug concentration in blood and detecting NAT2 gene polymorphism in patients with pulmonary tuberculosis. Methods: A total of 62 patients diagnosed with newly treated tuberculosis in the tuberculosis Department of Kunming Third People’s Hospital in 2020 were included in the study. Isoniazid was taken orally for 5 days, and peripheral venous blood was collected 2 hours after administration to detect the drug concentration in blood. Meanwhile, DNA was extracted and NAT2 gene polymorphism was analyzed by the Sanger method. SPSS 22 Pearson correlation analysis was performed to analyze the factors influencing isoniazid drug concentration in blood (including sex, age, weight, NAT2 gene polymorphism). Results: There was no correlation between sex, age and body weight and isoniazid drug concentration in blood, but there was a correlation between NAT2 metabolism isoniazid drug concentration in blood. Among the 62 patients, there were 22 NAT2 fast metabolizers (35.5%), 29 NAT2 intermediate metabolizers (46.8%) and 11 NAT2 slow metabolizers (17.7%). Among the 11 patients with slow metabolism, there were 6 cases of NAT2*6A*6A, accounting for 54.5%, 4 cases of NAT2*7B*7B, accounting for 36.4%, and 1 case of NAT2*5B*5B, accounting for 9.1%. Pearson correlation analysis showed that the polymorphism of NAT2 gene was correlated with isoniazid drug concentration in blood (P = 0.03). Conclusions: The NAT2*6A*6A and NAT2*7B*7B genotypes may be the main slow metabolizers of NAT2, and patients carrying this allele are prone to high drug concentration in blood of isoniazid. There was a correlation between NAT2 gene polymorphism and isoniazid drug concentration in blood. NAT2 gene polymorphism is one of the important factors affecting the drug concentration in blood of isoniazid. In clinical use of isoniazid, the dose can be adjusted according to the NAT2 gene polymorphism, and the drug concentration in blood can be monitored to achieve a more accurate treatment plan.
1. 引言
结核病(Tuberculosis, TB)，是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染引起的严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病，是全球十大死亡原因之一。据世界卫生组织(WHO)报道[1] [2]，2018年全球约有1000万人新发结核病，2019年约有996万人，相当于每10万人中就有132人罹患结核病。中国作为结核病高负担国家，2018年约有86.6万人新发结核病，2019年约有83.3万人，相当于每10万人中就有60人罹患结核病。异烟肼(Isoniazid, INH)作为一线抗结核药物，能够影响MTB细胞壁的合成，对生长旺盛的MTB呈杀菌作用，是目前抗结核治疗的基础药物之一。目前临床上INH多采用指南推荐剂量4~6 mg/Kg/天给药[3]，但患者血药浓度却存在非常大的差异(3~7倍) [4]-[8]，在我院临床工作中也常遇到这样问题，目前国内外多数研究报道认为造成这种现象的原因主要是不同个体代谢INH的程度不同。2015年7月，国家卫健委颁布了一项指南《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》[5]，指出在使用异烟肼时可以根据NAT2基因多态性适当调整其剂量，剂量调整的总体原则是快代谢型 > 中间代谢型 > 慢代谢型。但该指南并未给出其他的具体建议，而在2021年最新专家共识[9]里不但给出了NAT2基因型与乙酰化代谢类型的关系，患者乙酰化类型与异烟肼用药建议，同时还给出了异烟肼血药浓度监测时的采血时间点，采血注意事项，目标浓度范围，NAT2基因多态性检测技术，质量控制等相关的规范意见。因此本研究拟通过入组肺结核患者进行异烟肼血药浓度监测，再检测NAT2基因多态性，探讨其与异烟肼血药浓度的关系。
2. 材料与方法
2.1. 初治结核患者异烟肼血药浓度检测
入组条件：病例来源为我院2020年结核一科诊断为初治肺结核的患者。排除中重度(中度肝损伤：ALT (2-5) × ULN或TBIL < 2 × ULN；重度肝损伤：ALT > 5 × ULN，TBIL > 5 × ULN或ALT > 3 × ULN且TBIL > 5 × ULN)肝损伤患者，排除严重肾功能不全患者(肌酐清除率 < 30 ml/min)患者；排除有严重造血系统疾病(如白血病、再生障碍性贫血)或其它严重或进行性基础疾病(如恶性肿瘤)患者；排除合并使用肝药酶抑制剂(氯丙嗪、西咪替丁、环丙沙星、甲硝唑、保泰松等)及诱导剂(苯妥英、苯巴比妥、卡马西平、格鲁米特等，利福平除外)。
入组患者基本信息：按上述条件筛选后，本次研究共纳入了67例患者(男42，女25)，其中5例(男4，女1)因患者出院排除。62例中，男38例，女24例；最小年龄17岁，最大年龄64岁，平均年龄37.5岁；最小体重41 Kg，最大体重87 Kg，平均体重66.5 Kg。见表1。
Table 1. Patient basic information table
表1. 患者基本信息表
基本信息 |
最小 |
最大 |
(
) |
年龄(岁) |
17 |
64 |
37.5 ± 10.99 |
体重(Kg) |
41 |
87 |
62.5 ± 10.82 |
给药剂量：所有患者异烟肼给药剂量按5 mg/Kg计算，四舍五入后取整数剂量给药，口服。
采血时间：患者规律服用异烟肼5天，在下一次用药后2 h用EDTA抗凝管采集外周静脉血3~5 ml，采血后立即放冰箱冷藏，6 h内均检测完成。
2.2. NAT2基因多态性分析
方法：双脱氧链终止法(Sanger法)，其原理为根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在一个特定的碱基处终止，在每个碱基后面进行荧光标记，产生A、T、C、G四组不同长度的核苷酸，再进行毛细管电泳，从而获得DNA碱基序列。SNP序列在NCBI网站上获取，以碱基形式呈现。
引物设计：长度大约在18~24 bp内，理论退火温度Tm值约在55℃~65℃，G + C含量约35%~75%，扩增片段大小通常小于800 bp，其引物信息见表2。
PCR扩增目的片段，反应体系、扩增程序见表3、表4。
测序PCR反应：将合成好的引物用1*TE溶解到浓度为10 pmol，将一组中的引物加到一起，混匀，离心，然后配制PCR体系：DNA 1.5 μl，2*PCR mix 7.5 μl，混合引物2 ul，H2O补至15 μl。将配制的PCR总管分装到96孔PCR板中，离心，每孔加入2 μl DNA样品，离心，上PCR仪，上机条件见表5。
PCR产物纯化：取3 μl PCR产物用ExoI AP纯化，主要是用ExoI去除反应产物中的剩余引物，Fast AP去除反应中剩余的DNTP。37℃ 15 min，80℃ 15 min，干燥后4℃避光保存，纯化体系见表6。
Table 2. NAT2 primer information
表2. NAT2引物信息
引物名称 |
碱基序列(5' → 3') |
NAT2-341-前向引物 |
CAAATACAGCACTGGCATGGTTC |
NAT2-341-反向引物 |
Bio-GAAAATGCAAGGCACCTGAG |
NAT2-341-测序引物 |
CTCCTGCAGGTGACCA |
NAT2-590-前向引物 |
Bio-GACCAAATCAGGAGAGAGCAGTAT |
NAT2-590-反向引物 |
CCACCAAACAGTAAACCCCTTCT |
NAT2-590-测序引物 |
TAGACTCAAAATCTTCAATT |
NAT2-857-前向引物 |
GTGGGCTTCATCCTCACCTATAGA |
NAT2-857-反向引物 |
Bio-CGTGAGGGTAGAGAGGATATCTGA |
NAT2-590-测序引物 |
CCAAACCTGGTGATG |
Table 3. PCR reaction system
表3. PCR反应体系
引物序列PCR反应体系(25 μl) |
模板 |
1 μl |
引物F/R (10 μM) |
0.5 μl/0.5 μl |
10 * buffer |
2.5 μl |
dNTPs |
0.5 μl |
ddH2O |
19.5 μl |
酶 |
0.5 μl |
Table 4. PCR amplification program
表4. PCR扩增程序
PCR扩增程序 |
95˚C |
5 min |
1次循环 |
95˚C |
30 s |
|
55˚C |
30 s |
35次循环 |
72˚C |
40 s |
|
72˚C |
7 min |
1次循环 |
4˚C |
forever |
|
Table 5. PCR machine operating conditions
表5. PCR仪上机条件
PCR仪上机条件 |
95˚C |
3 min |
|
94˚C |
15 s |
|
55˚C |
15 s |
35次循环 |
72˚C |
30 s |
|
72˚C |
3 min |
|
Table 6. Purification system for PCR products
表6. PCR产物纯化体系
PCR产物纯化体系 |
PCR产物 |
3 μl |
ExoI |
0.2 μl |
Fast AP |
0.8 μl |
ExoI buffer |
0.7 μl |
H2O |
补至7 μl |
上样测序：取出变性后的样品，采用3730XL进行测序。测序结果出来后按2021年《结核病患者N-乙酰基转移酶2编码基因多态性检测与异烟肼合理用药专家共识》推荐得出患者NAT2代谢类型。
3. 结果
3.1. 初治结核患者异烟肼血药浓度检测
初次检测25例(男14、女11)异烟肼在有效血药浓度范围内(3~6 mg/L)，26例(男17、女9)异烟肼血药浓度 < 3.0 mg/L，11例(男7、女4)异烟肼血药浓度 > 6.0 mg/L。见表7。
Table 7. Initial detection of isoniazid blood concentration
表7. 初次检测异烟肼血药浓度情况
初次检测结果 |
总例数(例) |
男(例) |
女(例) |
平均浓度(mg/L) |
3~6 mg/L |
25 |
14 |
11 |
4.41 |
<3.0 mg/L |
26 |
17 |
9 |
1.51 |
>6.0 mg/L |
11 |
7 |
4 |
7.34 |
3.2. NAT2基因多态性分析
测序峰形图：采用双脱氧链终止法(Sanger法)检测，根据结果峰型图判断位点是否发生突变，若某个位点与已知序列野生型一样，说明没有发生突变，如果不一样，说明发生了突变，如果是双峰，说明是杂合子。见图1。
测序结果：62例患者中，NAT2快代谢型22例(男14，女8)，占比35.5%，中间代谢型29例(男16，女13)，占比46.8%，慢代谢型11例(男8，女3)，占比17.7%，见表8。
11例慢代谢型患者中，NAT2*6A*6A有6例，占慢代谢型患者比例为54.5%，NAT2*7B*7B有4例，占慢代谢型患者比例为36.4%，NAT2*5B*5B有1例，占慢代谢型患者比例为9.1%。62例患者中，341(T→C)野生纯合TT型49例，占比79.0%，突变杂合TC型12例，占比19.4%，突变纯合CC型1例，占比1.6%；590 (G → A)野生纯合GG型37例，占比59.7%，突变杂合19例，占比30.6%，突变纯合6例，占比9.7%；857 (G → A)野生纯合GG型43例，占比69.4%，突变杂合15例，占比24.2%，突变纯合4例，占比6.4%，见表9。
3.3. Pearson相关性分析
利用相关分析研究异烟肼血药浓度(mg/L)分别和NAT2代谢型，体重(Kg)，年龄(岁)，性别共4项之间的相关关系，使用Pearson相关系数去表示相关关系的强弱情况。从分析结果可知：性别、年龄、体重
Figure 1. Sequencing peak shape chart
图1. 测序峰形图
Table 8. Sequencing results
表8.测序结果
NAT2代谢型 |
男(例) |
女(例) |
合计(例) |
占比 |
初次给药平均浓度 |
快代谢型 |
14 |
8 |
22 |
35.5% |
1.61 mg/L |
中间代谢型 |
16 |
13 |
29 |
46.8% |
4.02 mg/L |
慢代谢型 |
8 |
3 |
11 |
17.7% |
7.11 mg/L |
Table 9. Frequency of base mutations
表9. 碱基突变频率
位点 |
341 (T → C) |
590 (G → A) |
857 (G → A) |
基因型 |
TT |
TC |
CC |
GG |
GA |
AA |
GG |
GA |
AA |
例数 |
49 |
12 |
1 |
37 |
19 |
6 |
43 |
15 |
4 |
占比 |
79.0% |
19.4% |
1.6% |
59.7% |
30.6% |
9.7% |
69.4% |
24.2% |
6.4% |
Table 10. Pearson correlation analysis
表10. Pearson相关性分析
影响因素 |
r值 |
P值 |
结果 |
性别 |
0.030 |
0.816 |
无相关性 |
年龄 |
0.227 |
0.076 |
无相关性 |
体重 |
0.055 |
0.672 |
无相关性 |
NAT2代谢型 |
0.276 |
0.030 |
具有相关性 |
与异烟肼血药浓度不具有相关性，而NAT2代谢型异烟肼血药浓度具有相关性，见表10和图2。
4. 讨论
NAT2是人体中一种重要代谢酶，异烟肼在体内主要依赖该酶的代谢(约占50%~90%)。目前NAT2
Figure 2. Pearson correlation visualization
图2. Pearson相关性可视化图
代谢型主要分为三种类型：快乙酰化型、中间乙酰化型和慢乙酰化型[10]。慢乙酰化型增加了异烟肼经酰胺酶代谢为酰肼的途径，后者易产生毒性物质，该代谢型的患者可能与肿瘤、帕金森病等多种疾病的发生和发展有关[11]-[14]。不同地区(主要为亚洲、欧洲、美洲和非洲)、不同种族(主要体现在黄种人、白种人和黑人)的人群，其NAT2基因型存在明显的差异[15] [16]。国内王宁[17]等经文献检索，纳入了国内10项研究，包含4010例个体NAT2基因型分布数据，研究地区包含了北京、上海、广州、长沙、郑州、南宁和台北，其结果NAT2快代谢基因型占25.79%，中间代谢基因型占50.87%，慢代谢基因型占23.34%。本研究62患者中，NAT2快代谢型22例，占比35.5%；中间代谢型29例，占比46.8%；慢代谢型11例，占比17.7%。这与上述国内报道略有出入，分析原因可能有以下两点：1、本次研究纳入病例数少，62例，可能存在样本量稍有偏差的情况；2、纳入病例中主要为云南地区人群，其次为贵州、四川、重庆、广西等地，汉族占比高77.42% (48/62)，壮族次之16.13% (10/62)，其次彝族3.23% (2/62)、回族1.61% (1/62)、纳西族1.61% (1/62)，因此可能存在地区和种族差异。
目前多数研究认为NAT2基因多态性在异烟肼等药物的代谢过程中起了重要的作用[18] [19]，采用标化剂量4~6 mg/L给药后，患者血药浓度却存在非常大的差异(3~7倍) [4]-[8]。国内有研究报道[20]，NAT2慢代谢型患者的异烟肼血浆浓度与快代谢型患者的血浆浓度存在差异，国外也有类似的报道[21]。上述研究说明NAT2基因型与异烟肼的血药浓度具有一定相关性。但也有少数报道NAT2快、中、慢代谢型与异烟肼血药浓度关系比较，差异无统计学意义[22]。张亮等[23]单因素分析的结果表明，年龄、体表面积、白蛋白水平、肝功能水平、合并基础疾病与异烟肼血药浓度存在显著的相关性，而性别和NAT2的两个位点的基因多态性没有显著相关性。本研究中，异烟肼血药浓度与NAT2基因多态性之间具有显著的正相关性(P = 0.03)，与国内多数报道相符。此外，本次研究中NAT2*6A*6A与NAT2*7B*7B基因型占慢代谢型比例为90.9%，可能为主要的NAT2慢代谢型。
5. 结论
NAT2*6A*6A与NAT2*7B*7B基因型可能为主要的NAT2慢代谢型，携带该等位基因的患者易导致异烟肼血药浓度偏高；NAT2基因多态性与异烟肼血药浓度具有相关性。NAT2基因多态性是影响异烟肼血药浓度的重要因素之一，临床在使用异烟肼时可根据NAT2基因多态性调整用药剂量，同时监测其血药浓度以达到更精准的治疗方案。
基金项目
昆明市卫健委卫生科研课题项目(项目编号：2022-13-01-003)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。