1. 引言

白花鬼针草(Bidens.pilosa var.radiata)为菊科鬼针草属植物，分布于我国各地区，是一种广泛应用于我国民间的药物，常用于清热解毒、活血化瘀等，也被众多少数民族如白族、苗族、壮族等用来治疗腹泻、呼吸道感染、咽喉肿痛、风湿关节痛等疾病。白花鬼针草为1年生或多年生直立草本植物，株高在0.3~1.5 m，条状披针形叶，茎下叶三裂或不裂，通常在开花前凋落。头状花序有1~6 cm的花序梗，单个花序中果实数量可达(47.6 ± 9.5)个[1] [2]。舌状花4~8枚，白色长5~8 mm，盛花期4~11月，其他月份也有开花。盘花为筒状，长约4.5 mm。果实为瘦果，条形黑色，具倒刺毛，易沾附于动物或人体上。

白花鬼针草中含有丰富化合物，主要有黄酮类、聚炔类以及萜类等成分。此外，鬼针草还含有多种对人体健康有益的氨基酸和铁、锌、铜、锰、钴等微量元素。黄酮类化合物是白花鬼针草中具有显著药理作用的主要有效成分[3] [4]。白花鬼针草的多种聚多炔糖苷化合物在降血糖、抗炎、抗菌等方面具有较好的生物活性[5]-[8]。聚多炔糖苷化合物是白花鬼针草的特色成分，其C₁₃长链聚多炔糖苷Cytopiloyne (2-β-D-glucopyranosyloxy-1-hydroxy-trideca-5,7,9,11-tetrayne)可以抑制小鼠T细胞干扰素-γ等多种炎症因子的释放，诱导抗炎因子白细胞介素-4 (IL-4)的产生，通过抑制Th0细胞分化为Th1细胞，促进Th0细胞分化为Th2细胞来预防糖尿病[6]。聚多炔糖苷Cytopiloyne还可以作为免疫调制剂，通过蛋白激酶C (PKC)途径增强小鼠巨噬细胞溶酶体酶活性及其吞噬近平滑假丝酵母能力[9]。

全球糖尿病患病人数不断上升，全球平均增长率为51%，目前有4.63亿糖尿病患者，按照增长趋势到2045年全球将有7亿糖尿病患者。聚多炔糖苷Cytopiloyne在降血糖方面有较好的效果，但Cytopiloyne在白花鬼针草植物中含量较低，提取分离需消耗大量有机试剂，工艺复杂，利用制备HPLC方法从2.8 kg鲜重的白花鬼针草中仅提取到约15 mg [8]。这些限制了聚多炔糖苷Cytopiloyne的临床研究和推广使用。

目前植物天然产物的化学合成技术发展较生物学合成技术成熟，合成化学所需的底物和催化剂相对容易获得，但受植物代谢产物的结构复杂性、化学合成的获取成本高、反应步骤长且条件严苛和获取率低等因素影响，化学合成植物代谢产物的方法仍很难工业化应用，利用合成生物学异源合成聚多炔糖苷Cytopiloyne是提高其产量的有效途径之一。合成生物学中通常以安全无害的微生物为宿主，比如大肠杆菌、酿酒酵母等，在生物体中采用从最上游途径合成开始，将某种生物体中的天然功能原件改造成特定功能的模块，通过组装构建到宿主生物体内，使其获得新的功能。近年来，多种高价值的药用活性分子如青蒿素、人参皂苷、紫杉醇、灯盏乙素、丹参酮、白藜芦醇等在合成生物学研究中取得了较大进展，具备了一定的工业化生产潜力[10]-[15]。

白花鬼针草聚多炔糖苷化合物的合成途径尚未解析。长链聚多炔类化合物是由常见的不饱和脂肪酸类成分经过一系列的水解、氧化、还原等途径衍生而来的。糖基转移酶是聚多炔糖苷化合物合成后期中重要的关键酶。

糖基转移酶是一类广泛存在于有机体中能催化特定的糖基与受体之间形成糖苷键的一个多成员的转移酶家族。糖基转移酶属于碳水化合物活性酶家族，根据氨基酸序列的相似性、糖苷键的立体化学结构及底物特异性等可将其划分为106个基因家族。其中以尿苷酸二磷酸糖为供体的UGT (UDP-dependent glycosyltransferases)家族是含有糖基转移酶数量最多的家族。其中，与植物次生代谢相关的绝大部分糖基转移酶基因均归属于GT1家族。糖基转移酶是化合物糖基化修饰的强有力工具，并在植物次生代谢过程中起着重要作用。糖基化可改变苷元分子的极性、溶解性、稳定性、细胞定位和生物活性，并参与植物生长、发育及次生代谢过程。而去除糖基后，则会导致某些天然产物的生物活性完全丧失或急剧降低。

UGT超家族含有被称为“植物次级产物糖基转移酶盒PSPG Box”的高保守性的C末端共有序列，该结构域由44个氨基酸组成，推测这一特殊的结构可能与糖基供体的结合有关，参与尿苷二磷酸糖基供体的结合，将糖基从活化的分子转移到特定的受体分子[16] [17]。

以糖基转移酶盒“PSPG Box”的C末端共有序列blast白花鬼针草unigene翻译的蛋白序列集，筛选到95个糖基转移酶UGT。我们前期研究的结果表明，聚多炔糖苷在白花鬼针草的叶、花中含量较高，在根、果实中含量非常低。对95个白花鬼针草糖基转移酶基因进行表达层次聚类，有19个糖基转移酶基因在花、叶中表达量高，在根中表达量低，这19个基因为白花鬼针草聚多炔糖苷化合物合成途径中糖基转移酶候选基因。为进一步缩小参与白花鬼针草聚多炔糖苷化合物合成的糖基转移酶筛选范围，本研究利用qRT-PCR技术对白花鬼针草DN19630等19个候选糖基转移酶基因在不同组织部位的表达情况分析。

2. 方法

2.1. 候选糖基转移酶基因和引物设计

根据白花鬼针草转录组数据库中的基因序列，筛选得到DN19630等19条糖基转移酶基因的DNA序列和内参基因DN8598、DN6387，使用Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计试验所需引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物(序列详见表1)。

2.2. 提取白花鬼针草总RNA

使用上海索宝生物科技有限公司的OMEGA plant RNA kit (R6870-01)提取白花鬼针草的各部位

Table 1. The primer sequences for the candidate glycosyltransferase genes

表1. 候选糖基转移酶基因引物序列

续表

(根、茎、叶、花、果)的总RNA，在干冰预冷下将其研匀成粉末，转移至新离心管中，按照说明书的流程分别提取根、茎、叶、花、果的总RNA，每个样品三个生物学重复。

2.3. RNA逆转录成cDNA

将提取的白花鬼针草不同部位的总RNA，用NanoDrop核酸检测仪测量其纯度(A_260nm/A_280nm比值)和浓度后，再使用安诺伦(北京)生物科技有限公司的StarScript II cDNA第一链合成预混试剂盒(Abs601510)获得白花鬼针草根、茎、叶、花、果的cDNA。

2.4. PCR扩增

以白花鬼针草的cDNA为模板，用19个候选糖基转移酶基因分别做PCR扩增，反应结束后使用2%琼脂糖凝胶电泳仪检测产物扩增情况。PCR反应程序为预变性94℃ 2 min，变性94℃ 30 s，退火55℃~65℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，变性–退火–延伸35个循环，终延伸72℃ 2 min。

2.5. 实时荧光定量PCR

使用常州百代生物的BIOGHC SYBR Green荧光定量PCR试剂盒和Bio-Rad荧光PCR仪(CFX96 TOUCH)，内参基因选用泛素连接酶基因(DN8598和DN6387)，依照试剂盒的说明书及Bio-Rad荧光PCR仪的使用方法对19个候选糖基转移酶基因进行实时荧光定量PCR分析。

3. 结果

3.1. RNA纯度和浓度测定

本研究通过NanoDrop检测仪对提取的白花鬼针草不同部位的总RNA进行了A_260nm/A_280nm比值和RNA浓度的测定(见表2)，每种组织三个生物学重复。结果表明，总RNA的A_260nm/A_280nm值均在1.8~2.2之间，符合后续实验要求。

Table 2. The Results of the Sample Total RNA

表2. 样品总RNA检测结果

续表

3.2. 候选糖基转移酶基因的qRT-PCR引物特异性检测

用白花鬼针草不同组织部位的cDNA作为模板，用DN19630等候选糖基转移酶基因的qRT-PCR引物配制PCR反应体系，并用2%琼脂糖凝胶电泳仪检测扩增产物。如图1所示，DN19630等19个糖基转移酶基因的等qRT-PCR引物以白花鬼针草叶、茎、花、根、果的cDNA为模板特异扩增出单一条带。

注：L，叶；S，茎；Fl，花；R，根；Fr，果。

Figure 1. Electrophoresis images of qRT-PCR products of 19 candidate glycosyltransferase genes such as DN19630

图1. DN19630等19候选糖基转移酶基因的qRT-PCR引物的PCR产物电泳图

注：曲线导数图中横坐标为温度，纵坐标为-d(RFU)/dT。

Figure 2. Melting curve profiles of qRT-PCR products for 19 candidate glycosyltransferase genes such as DN19630

图2. DN19630等19候选糖基转移酶基因的qRT-PCR产物的熔解曲线图

如图2所示，DN19630等19个候选糖基转移酶基因引物的qRT-PCR扩增产物熔解曲线导数图在80℃~90℃之间均为特异的单一峰，不存在引物二聚体，说明引物特异性较好，反应专一性高，符合qRT-PCR引物标准，可以进行后续的qRT-PCR实验。

3.3. 候选糖基转移酶基因的表达分析

用DN19630等19个候选糖基转移酶基因的qRT-PCR引物和白花鬼针草不同组织的cDNA配制qRT-PCR的反应体系，以2个泛素连接酶Ubc的DN8598和DN6387作为内参基因，在Bio-Rad荧光PCR仪(CFX96 TOUCH)中检测19个候选糖基转移酶基因组织特异性表达情况，并以叶中表达量为1分析在白花鬼针草不同组织部位中基因的相对表达情况。

注：L，叶；S，茎；Fl，花；R，根；Fr，果。

Figure 3. Expression profiles of 19 candidate glycosyltransferase genes across various tissues such as DN19630

图3. DN19630等19候选糖基转移酶基因在各组织的表达情况

如图3所示，DN19630、DN18211、DN12914、DN6852、DN5000g2、DN38310、DN14409g1、DN5293、DN34556、DN14409g2、DN15831这11个候选糖基转移酶基因在叶中表达量相对较高，在根中表达量最低；而DN3608在茎中表达量最高，根中表达量较低；DN11811在叶中表达量较高，茎、叶、花、果实表达量相对较低，DN12483、DN10484在果实中表达量较高，在根中表达量最低；DN21732、DN14031在花中表达量较高，在根中表达量最低；DN5000g1在叶、茎、根中表达量较高，花和果实表达量较低；DN237在花、茎和果实的表达量较高，叶、根中表达量较低。

4. 讨论

本研究通过深入分析白花鬼针草不同组织中候选糖基转移酶基因的表达规律，初步筛选出可能参与聚多炔糖苷生物合成途径的关键糖基转移酶。聚多炔糖苷是一类具有重要生物活性的天然产物，其在白花鬼针草中的分布及其生物合成机制一直是研究热点。通过前期对白花鬼针草不同组织部位中聚多炔糖苷含量的测定，我们发现这类化合物在叶和花中含量较高，而在根和果实中含量较低。这一结果为后续糖基转移酶基因的筛选提供了重要的组织特异性线索。

利用qRT-PCR技术，对筛选出的19个候选糖基转移酶基因在白花鬼针草不同组织部位中的表达情况进行了详细分析。结果表明，DN19630、DN18211、DN12914等14个基因在叶或花中表达量相对较高，根中表达量较低，这与聚多炔糖苷在叶、花中的高含量及根中的低含量相一致，这表明这些基因可能在聚多炔糖苷的生物合成中发挥了重要作用。

虽然本研究筛选出了多个可能参与聚多炔糖苷生物合成的糖基转移酶基因，但并不意味着这些基因都直接参与了该化合物的合成。糖基转移酶在植物中往往具有广泛的底物特异性和功能冗余性，因此，要确定某个基因是否直接参与聚多炔糖苷的生物合成，还需要通过体外酶活实验、转基因验证等进一步手段进行确认。

综上所述，本研究通过qRT-PCR技术对白花鬼针草中19个候选糖基转移酶基因的表达情况进行了全面分析，初步筛选出了多个可能参与聚多炔糖苷生物合成的关键基因。这些结果为后续深入研究白花鬼针草聚多炔糖苷的生物合成机制提供了重要的数据支持和研究方向。未来的研究将进一步聚焦于这些候选基因的功能验证和机制解析，以揭示聚多炔糖苷生物合成的完整途径和调控机制。

基金项目

贵州省省级科技计划项目(黔科合基础-ZK[2021]一般538)；贵州省教育厅青年人才成长项目(黔教技[2022]206)；贵州省2023年大学生创新创业训练计划项目(S202310662011，贵中医大创合字(2023) 54号)。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献