1. 引言

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是发生于鼻咽黏膜被覆上皮及小涎腺的恶性肿瘤，是我国南方地区的高发性疾病[1]。放化疗是目前治疗鼻咽癌的有效方法，但70%的患者确诊时已为晚期，存在远处转移及复发问题[2]。但是，放化疗常见有放射性口腔黏膜损伤、消化道反应、骨髓抑制等不良反应[3]。因此，寻求安全高效的治疗方法是NPC治疗亟待解决的临床问题。

目前，中医药抗肿瘤药物日益受到关注，因其与化疗药物相比，在抑杀肿瘤细胞的同时，具有毒副作用小、不易产生耐药性等优势[4]。山豆根(Sophora tonkinensis Gagnep)为豆科植物越南槐的干燥根和根茎，又名广豆根，具有清热解毒、消肿利咽的功效，可用于治疗火毒蕴结、乳蛾喉痹、咽喉肿痛、齿龈肿痛、口舌生疮[5]。现代药理学研究表明山豆根具有良好的抗肿瘤活性，可通过多成分、多靶点、多通路抑制肿瘤细胞增殖、分化、迁移和诱导凋亡，对多种类型的恶性肿瘤均有较好的抗癌效果，具有较高的药用研究价值[6]。

基于此，本研究应用网络药理学和分子对接的方法来探索山豆根抗鼻咽癌的作用靶点和活性成分，为进一步研究山豆根治疗鼻咽癌的作用机制提供新的思路与方法。

2. 资料与方法

2.1. 中药活性成分及作用靶点的获取

通过液相色谱–质谱联用技术(LC-MS)共获得山豆根的147个成分。运用Pubchem数据库 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获取山豆根有效成分smiles号，将获取的选取的smiles号输入到Swiss Target Prediction数据库(http://swisstargetprediction.ch) [7]中筛选山豆根治疗疾病的作用靶点；对靶点进行合并、去重，运用UniProt数据库(https://www.uniprot.org)，限定物种为“Homo sapiens”，收集山豆根活性成分对应靶点的基因名。

2.2. 疾病相关靶点的获取与中药-疾病交集靶点的筛选

在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、CTD数据库(https://ctdbase.org/)中，以Nasopharyngeal Carcinoma为关键词获取鼻咽癌的潜在作用靶点。利用UniProt数据库规范靶点名称。

在Venny2.1.0在线软件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中获得中药–疾病的交集靶点。

2.3. PPI网络构建及核心靶点、成分的筛选

将中药–疾病交集靶点导入STRING数据库(https://cn.string-db.org)，选择“Homo sapiens”物种，置信度“medium confidence”值为0.900，隐藏孤立蛋白，下载TSV文件，构建蛋白互作网络(PPI) [8]。将相关数据导入Cytoscape软件，利用CytoNCA插件中Closeness参数进行分析，筛选山豆根抗鼻咽癌的核心靶点。

在Excel表格中建立“中药–活性成分–作用靶点–疾病”——对应关系的type文件，在Cytoscape软件导入构建好的关系文件，通过CytoNCA插件中Degree参数进行分析，筛选山豆根抗鼻咽癌的核心成分，同时构建“中药–活性成分–疾病靶点–疾病”相互作用网络图。

2.4. GO和KEGG通路富集分析

为了研究山豆根治疗鼻咽癌的主要生物学过程及代谢通路，将山豆根与鼻咽癌的交集靶点导入David在线平台(https://david.ncifcrf.gov)对获得的靶点进行GO富集分析和KEGG通路分析。选择生物过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)和细胞组分(cellular component, CC)对山豆根治疗鼻咽癌的靶点进行GO生物过程富集分析，富集结果P值越小表明相关程度越高。

分别选取P值最小的前10条生物学结果在微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn)进行可视化分析。KEGG通路富集分析同样以P值进行排序，选取前10条通路绘制条形图进行可视化分析。

2.5. 分子对接

在pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获取核心成分的SDF结构文件，Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)获得核心靶点的PDB结构文件，运用CB-DOCK2软件进行分子对接。

3. 结果

3.1. 山豆根活性成分筛选与靶点预测

通过液相色谱–质谱联用技术(LC-MS)共获得山豆根的147个成分，在Swiss Target Prediction数据库查找山豆根成分的作用靶点，将获得的活性成分靶点合并、筛选(Probability ≥ 50%)、去重后共得到62个潜在作用靶点以及31个主要活性成分。

3.2. 鼻咽癌相关靶点预测

在GeneCard数据库、OMIM数据库、CTD数据库中分别获得鼻咽癌相关靶基因，对获得的靶点数据进行合并、去重，经整理后共获得14,522个与鼻咽癌相关靶基因；绘制韦恩图获取山豆根抗鼻咽癌的51个作用靶点，见图1。

Figure 1. Intersection target map of Sophora tonkinensis Gagnep and nasopharyngeal carcinoma

图1. 山豆根和鼻咽癌的交集靶点图

3.3. “中药–活性成分–疾病靶点–疾病”相互作用网络图以及PPI分析

将中药与疾病潜在作用靶点取交集得到的51个共同作用靶点，导入至STRING数据库，获得PPI网络图。将PPI网络图数据导入Cytoscape软件中，利用CytoNCA插件中Closeness参数值进行筛选，选取排名靠前的五个靶点MMP9、MMP1、MMP2、IL2、TNF作为山豆根抗鼻咽癌的核心靶点。将type文件导入Cytoscape软件中，利用CytoNCA插件中Degree参数值进行筛选，选取排名靠前的三个化合物葛根素、白蜡树素、大豆苷三个化合物作为山豆根抗鼻咽癌的核心成分。在“中药–活性成分–疾病靶点–疾病”图中共有99个节点，其中来源于化合物的有31个，来源于基因的有66个(见图2)。

3.4. 基因本体GO功能富集分析与KEGG通路富集分析结果

将51个山豆根–鼻咽癌交集靶点蛋白导入DAVID数据库中进行GO和KEGG分析。GO基因本体分析结果显示，共得到148个富集结果，其中生物过程96项，细胞组成部分23项，分子功能富集29项。三项富集结果按P值大小排序，各选取排名前10的生物学结果可视化分析，结果如图3所示。生物过程主要涉及单碳代谢过程、兴奋性突触后电位、单原子离子跨膜转运等过程，细胞组成主要包含乙酰胆碱门控通道复合物、突触后膜、投射神经元、神经元胞体等，分子功能主要包含乙酰胆碱结合、锌离子

Figure 2. “Traditional Chinese medicine-active ingredient-disease target-disease” interaction network

图2.“中药–活性成分–疾病靶点–疾病”相互作用网络图

Figure 3. GO enrichment analysis

图3. GO富集分析

结合、碳酸盐脱水酶活性、蛋白酪氨酸磷酸酶活性等。

KEGG通路富集分析共富集到12条信号通路，根据结果的P值大小排序，选取排名前10的通路进行可视化分析，结果如图4所示。富集结果主要涉及到氮代谢信号通路、炎症性肠病信号通路、膀胱癌信号通路等信号通路等。

Figure 4. Bubble plot of KEGG pathway enrichment analysis

图4. KEGG通路富集分析气泡图

3.5. 分子对接验证

将“中药–活性成分–疾病靶点–疾病”相互作用网络中得到的3个核心成分，葛根素、白蜡树素、大豆苷为配体与蛋白质互作网络中确定的核心靶点MMP9、MMP2、MMP1、IL2、TNF为受体进行分子对接，对接结果如表1所示。据文献研究，当结合能 < −5 kcol·mol⁻¹时，配体和受体具有较好的结合活性，当结合能 < −7 kcol·mol⁻¹时，配体和受体具有强烈的结合活性[9]。根据分子对接结果显示，结合能均 < −5 kcol·mol⁻¹，表示山豆根中的核心成分与核心靶点间均具有较好的结合活性，预测结果可靠。

Table 1. Docking results of active ingredients and potential target molecules

表1. 活性成分与潜在靶点分子对接结果

4. 讨论与结论

鼻咽癌是一种浸润性高、转移性强的肿瘤，发现时往往已发生局部或远处转移[10]，在鼻咽癌的治疗中局部放疗加化疗可提高鼻咽癌患者的生存率[11]。但部分鼻咽癌患者对化疗不敏感，或不能承受高剂量化疗的副作用。研究表明，中医对鼻咽癌治疗有一定作用[12]鉴于山豆根药理作用中具有抗肿瘤活性，山豆根在鼻咽癌治疗中有较大应用潜力。因此本研究拟采用网络药理学方法分析其抗鼻咽癌的作用，并探讨其机制。

本研究以网络药理学为基础，对山豆根抗鼻咽癌进行了分析，筛选出山豆根治疗鼻咽癌主要包括葛根素、大豆苷、白蜡树素等活性成分；葛根素在抗肿瘤的方面都有显著性的疗效[13]，在邓晰文的研究中发现葛根素可抑制鼻咽癌CNE1细胞GPX4的表达，GPX4表达的下调和升高ROS的水平进而诱导鼻咽癌CNE1细胞铁死亡与葛根素的抗肿瘤作用相关。葛根素在治疗鼻咽癌CNE1细胞中的作用靶点及应用价值提供新的依据，但具体的抗肿瘤机制仍需进一步探究[14]。同时发现，山豆根可能通过作用于MMP9、肿瘤坏死因子(TNF-a)、MMP1、MMP2、IL2等核心靶点发挥作用，基质金属蛋白酶(Matrixmetal-loproteinase, MMPs)是锌离子依赖性内切酶性蛋白酶家族，能够通过降解细胞外基质(Extra cellular matrix, ECM)，在肿瘤细胞的侵袭破坏及转移过程中起到至关重要的作用[15]。鼻咽癌患者死亡的一个主要原因是发生转移[16]在鼻咽癌侵袭转移过程中，肿瘤细胞只有通过降解ECM并侵入血管，随全身血液循环才能到达转移靶器官[17]。基质金属蛋白酶(MMPs)是降解ECM最重要的蛋白水解酶[18]目前研究较多的是MMP-2、MMP-9 [19]。MMP9属于明胶酶，能水解明胶蛋白、弹性蛋白等细胞外基质的主要成分[20]。大量研究证明MMP9在肿瘤的侵袭和转移中有着重要的作用[21]。MMP-2是目前发现的基质金属蛋白酶家族二十多个种类中研究得最为广泛且最重要的一种侵袭性因子[22]，其在肿瘤细胞的浸润和转移、新生血管等恶性特征中也发挥着十分重要的作用[23] [24]。有研究表明，MMP-2、MMP-9在鼻咽癌细胞中表达量升高[18] [25]，并可促进细胞转移[26]。MMP1也属于基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)家族，MMP1消化I、III型胶原和蛋白多糖，使肿瘤细胞沿缺失的基底膜向周围组织浸润，促进癌细胞进一步侵袭和转移[27]。有研究显示，MMP1的高表达参与了鼻咽癌淋巴转移[28]，促进鼻咽癌的发病过程[29]。IL-2由Th1细胞分泌，是调节免疫应答的重要细胞因子，已有抵抗病毒、细菌感染，抑制肿瘤细胞增殖分化作用[30]。有关研究发现，IL-2通过促进T细胞增殖，诱导B细胞分泌抗体，提高T细胞杀伤作用，增强NK细胞活性，从而抑制肿瘤细胞活性作用[31]。研究结果发现[30]鼻咽癌患者血清IL-2水平明显低于正常者。鼻咽癌患者的IL-2水平明显低于正常人组[32]。TNF-α是一种促炎细胞因子，由单核细胞、巨噬细胞及许多其他细胞如成纤维细胞和内皮细胞产生，其表达的异常一定程度上反映了机体免疫功能状况[33]。在肿瘤中，TNF-α具有多种促肿瘤活性，如刺激细胞因子级联反应、纤维化反应和改变黏附受体数量，同时它在化学致癌物诱导的早期癌变中亦发挥重要作用[34]。有研究表明[35]，TNF-α表达的升高可反映鼻咽癌的严重程度。

综上，本研究结果表明山豆根对鼻咽癌的治疗涉及葛根素(puerarin)、大豆苷(daidzin)、白蜡树素(dimethylfraxetin)等活性成分以及MMP9、肿瘤坏死因子(TNF-α)、MMP1、MMP2、IL2等靶点，本研究基于网络药理学和分子对接技术探讨山豆根抗鼻咽癌作用机制和物质基础，阐述了多成分、多靶点间的复杂网络相互作用关系，为进一步开展动物模型实验提供了理论依据。

基金项目

国家自然科学基金项目(81960749)。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献