1. 引言
据最近发表的2022年中国癌症报告，肺癌在中国癌症发病率及相关死亡人数中均居首位[1]，而非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)在肺癌中最为常见，约占发病肺癌的80%~85%。近年来NSCLC患者的治疗取得了一定进展，但其具体的发病机制尚不明确，在NSCLC治疗方面取得重大突破的程序性细胞死亡蛋白1 (Programmed cell death 1, PD-1)/细胞程序性死亡-配体1 (Programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1)抑制剂，仍存在一半以上PD-L1阳性患者表现出无应答状态[2]，同时存在皮疹、肝炎、内分泌病等一系列免疫相关不良事件[3]，因此迫切需要对NSCLC发生及发展的机制进行揭示。
N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)作为在mRNA水平的一种甲基化修饰，在近期发现与肿瘤的发生、发展及预后存在密切联系。异常的m6A修饰会通过使调节细胞过程的关键基因失调，从而成为肿瘤发生发展的重要一环[4]。
YTH结构域连接蛋白2 (TYH binding family, YTHDF2)属于m6A阅读蛋白的一种，主要由C端的YTH结构域组成，课题组前期研究分析发现其表达水平与NSCLC的预后相关，并且经过对104对临床样本的肿瘤组织和癌旁组织的免疫组化检测，通过Spearman等级相关性分析验证了YTHDF2和十一易位酶2 (ten-eleven translocation 2, TET2)之间存在正相关性。TET2可以通过去除5mC在超甲基化的CpG岛和调控启动子中的甲基化表达来使基因得到激活，而p14启动子区域的高甲基化会导致p14表达水平的下降，从而间接影响肿瘤的进展[5]，提示TET2可能抑制p14启动子区域的高甲基化修饰而使p14表达增加，从而影响NSCLC的进展[6]。
本课题将m6A和抑癌基因p14相联系，首次用qRT-PCR实验证明了在NSCLC肿瘤组织中，YTHDF2和p14的相对表达水平呈正相关性(rs = 0.561, P < 0.001)，旨在对NSCLC发病和病理机制进行探索，对未来产生更加有效的NSCLC治疗手段和改善NSCLC患者的预后提供参考。
2. 资料与方法
2.1. 临床样本收集
本研究纳入64例NSCLC患者。其中42例为青岛大学胸外科2021年5月至10月期间确诊肺癌并住院手术患者的肿瘤和癌旁标本；22例是青岛大学胸外科2022年3月至5月期间确诊肺癌并住院手术患者的肿瘤和癌旁标本。肺癌的诊断根据世界卫生组织的形态学标准确定。根据美国联合癌症委员会(AJCC)的标准对肿瘤进行分期。获得所有患者的知情同意。
2.2. 标本分组
a) 肿瘤组织
b) 癌旁组织
收集NSCLC手术切除患者的肿瘤组织和癌旁组织，立即液氮冷冻并保存在−80℃进行后续分析。
2.3. HE染色
通过苏木精–伊红染色验证标本的组织学充分性，试剂及仪器内容见表1、表2。
Table 1. Laboratory reagent
表1. 实验试剂
名称 |
公司 |
规格 |
乙醇 |
国药集团 |
分析纯 |
二甲苯 |
国药集团 |
分析纯 |
中性树胶 |
国药集团 |
100 g |
伊红 |
Baso |
|
苏木素 |
Baso |
|
氨水 |
国药集团 |
分析纯 |
Table 2. Experimental instruments
表2. 实验仪器
名称 |
公司 |
货号 |
通风厨 |
Fume Hood |
|
电热鼓风干燥箱 |
上海仪天科学仪器有限公司 |
DHG-9240A |
2.3.1. 脱蜡
(1) 将组织玻片放入烤箱中65℃烤30分钟
(2) 在放入二甲苯缸进行脱蜡，共3缸二甲苯
(3) 二甲苯8分钟
(4) 二甲苯8分钟
(5) 二甲苯5分钟
(6) 再放入酒精缸洗去二甲苯，共计4缸
(7) 100%酒精5分钟
(8) 100%酒精5分钟
(9) 100%酒精5分钟
(10) 75%酒精3分钟
(11) 流水冲洗5分钟
2.3.2. 染色
(1) 苏木素染色3分钟
(2) 流水冲洗2分钟
(3) 0.25%盐酸酒精1~2秒
(4) 流水冲洗2分钟
(5) 0.1%氨水6秒
(6) 流水冲洗2分钟
(7) 伊红染色25秒
(8) 流水冲洗30秒
(9) 95%酒精20秒
(10) 100%酒精2分钟
(11) 100%酒精2分钟
(12) 二甲苯2分钟
(13) 二甲苯2分钟
(14) 中性树胶封片
2.4. qPCR检测基因表达
试剂及仪器见表3、表4。
Table 3. Laboratory reagent
表3. 实验试剂
名称 |
公司 |
货号 |
Trizol |
Sigma |
T9424-100m |
Hiscript QRT supermix for qPCR (+gDNA WIPER) |
Vazyme |
R123-01 |
AceQ qPCR SYBR Green master mix |
Vazyme |
Q111-02 |
Primer (R&F) |
金唯智 |
|
Table 4. Experimental instruments
表4. 实验仪器
名称 |
公司 |
货号 |
Nanodrop分光光度计 |
Thermo |
2000/2000C |
稳压电泳仪 |
上海天能 |
|
Real time PCR仪器 |
ABI公司 |
VII7 |
2.4.1. 总RNA抽提
(1) 收集细胞，2000 rpm离心5 min，去上清，细胞沉淀中加入1 ml Trizol，充分混匀后室温静置5 min，然后转移至新的1.5 ml EP管中；
(2) 每管加入200 μl氯仿，用手上下颠倒eppendorf管15 s，室温静置10 min；3.4℃，12,800 rpm，离心10 min；
(3) 吸取上层液体移至新的1.5 ml EP管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃静置10 min；
(4) 4℃，12,800 rpm离心10 min后，弃上清；
(5) 加入 1 ml 75%乙醇(用DEPC水新鲜配制)，洗涤沉淀；
(6) 4℃，11,800 rpm离心5 min，弃去大部分上清；
(7) 4℃，11,800 rpm离心5 min，弃去上清；室温干燥；
(8) 待RNA沉淀基本透明时，加入RNase-free水(加入体积视RNA沉淀量而定)至完全溶解，Nanodrop 100分光光度计分析测定所抽提RNA的浓度及质量。
2.4.2. RNA逆转录获得cDNA
(1)将4X gDNA wiper mix和1.0 μg total RNA加入到PCR水管中，补充RNase-Free H2O至8 μl，混匀后离心，42℃温浴2 min；
(2) 加入5X qPCR supermix 55℃ 15 min，85℃ 2 min程序进行逆转录；
(3) 将得到的RT产物——cDNA置于−80℃保存备用
2.4.3. Real-time PCR 检测
(1) 按下列比例配置反应体系，见表5：
Table 5. Configuration ratio
表5. 配置比例
试剂 |
每管加入量 |
SYBR Green mastermixs |
5.0 μl |
上游引物(10 μM) |
0.25 μl |
下游引物(10 μM) |
0.25 μl |
Dye2 |
0.2 μl |
cDNA |
2.0 μl |
RNase-Free H2O |
2.3 μl |
(2) 两步法进行Real-Time PCR，并制作熔解曲线。
2.4.4. 数据分析
相对定量分析F = 2−ΔΔCt
ΔCt = 目的基因Ct值 − 内参基因Ct值；
ΔΔCt = 肿瘤组织ΔCt平均值 − 癌旁组织ΔCt值平均值；
ΔΔCt反映各肿瘤组织样品相对癌旁组织样品目的基因的相对表达水平。
2.5. WB检测组织/样本蛋白表达水平
2.5.1. 组织总蛋白抽提
① 组织称重，切小块放入管中；② 配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂(1 ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5 μl磷酸酶混合液)；③ 加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂(250 mg组织中加入1 ml抽提试剂)；④ 用匀浆器每次30秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1分钟，至组织完全裂解；⑤ 裂解液于预冷的离心机中14,000 xg离心15分钟。上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。
2.5.2. SDS-PAGE
① 制胶：根据目的蛋白分子量大小配制不同浓度的胶，具体体系见表6。
② 上样：等胶凝固好后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品进行上样。
③ 电泳：恒压80 V，30 min，至出现72 kDa时，再将电压调至120 V继续电泳50 min左右至溴芬蓝到达凝胶底部。
④ 免疫印迹(湿转)：电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃，300 mA恒流条件下电转90 min，将蛋白转移到PVDF膜上。
Table 6. Separation gel system
表6. 分离胶体系
分离胶(10 ml体系) |
|
8% |
9% |
10% |
12% |
13% |
15% |
H2O |
4.6 |
4.3 |
4 |
3.3 |
2.9 |
2.3 |
30% Acryl/Bis |
2.7 |
3 |
3.3 |
4 |
4.5 |
5 |
1.5 mol/L Tris (pH 8.8) |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
10% SDS |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
10% APS |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
TEMED |
0.006 |
0.004 |
0.004 |
0.004 |
0.004 |
0.004 |
浓缩胶(5%) |
|
3 ml |
4 ml |
5 ml |
H2O |
2.1 |
2.7 |
3.4 |
30% Acryl/Bis |
0.5 |
0.67 |
0.83 |
1.5 mol/L Tris (pH 8.8) |
0.38 |
0.5 |
0.63 |
10% SDS |
0.03 |
0.04 |
0.05 |
10% APS |
0.03 |
0.04 |
0.05 |
TEMED |
0.003 |
0.004 |
0.005 |
⑤ 免疫显色：
A) 封闭：用封闭液(含5脱脂牛奶的TBST溶液)室温摇床封闭PVDF膜1 h；
B) 一抗孵育见表7：封闭液稀释抗体，然后把封闭好的PVDF膜室温孵育2 h或4℃过夜；
C) 洗膜：TBST洗膜3次，每次10 min；
D) 二抗孵育见表8：用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜1 h；
E) 洗膜：TBST洗膜3次，每次10 min；
F) 采用Millipore公司immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrote试剂盒进行显色；
G) 化学发光：使用化学发光成像仪进行化学发光。
Table 7. First antibody information
表7. 一抗信息
抗体名称 |
目的大小kDa |
稀释倍数 |
一抗来源 |
公司 |
货号 |
YTHDF2 |
62 |
1:2000 |
Rabbit |
Proteintech |
24744-1-AP |
GAPDH |
36 |
1:30000 |
Mouse |
Proteintech |
60004-1-lg |
Table 8. Second antibody information
表8. 二抗信息
抗体名称 |
公司 |
货号 |
Goat Anti-Rabbit |
Beyotime |
A0208 |
Goat Anti-Mouse |
Beyotime |
A0216 |
2.6. Tunel染色
(1) 通透，使用ProteinaseK处理玻片，37摄氏度孵育30分钟。
(2) 漂洗，使用PBST洗涤5分钟 × 3次。
(3) 封闭，使用5%的山羊血清对玻片进行封闭，室温30分钟。
(4) 阳性对照组制备，对照组玻片加入100 ul DNase1，15℃~25℃反应10分钟。
(5) 阴性对照组，阴性组只加50 ul荧光素标记的dUTP液。
(6) Tunel工作液配制，TdT工作液和荧光素标记的dUTP工作液按1:9比例混合。配制好的工作液按照2~3倍进行稀释后使用。
(7) 染色，配制好的Tunel工作液加入到封闭完的玻片上，37℃孵育1小时。
(8) 漂洗，使用PBST洗涤5分钟 × 3次。
(9) 染核，使用1:100稀释的DAPI染细胞核，室温5分钟。
(10) 漂洗，使用PBST洗涤5分钟 × 3次。
(11) 封片，使用水溶性封片剂进行封片。
(12) 密封，使用指甲油或中性树胶对盖玻片四周进行封闭，以便长期保存。
(13) 拍照，使用红光，蓝光和白光分别对玻片进行拍照，根据红光下细胞数和蓝光下细胞核数量计算Tunel凋亡率。
2.7. 生信分析(TET2)
选择RMBase v2.0数据库基因TET2的m6A水平，RMBase v2.0数据库是一个综合性数据库(网址：https://rna.sysu.edu.cn/rmbase/m6Amod.php)，用于整合转录组测序数据，以探索RNA的转录后修饰，以及它们与microRNA结合事件，疾病相关SNP和RNA结合蛋白(RBP)的关系。简单来说是一个RNA水平表观遗传修饰查询的数据库，m6A、m5C等都可以查询。该数据库由屈良鹄教授实验室构建。该项目关注m6A的修饰。现在的RMBase v2.0扩展了13个物种的47个研究中的566个数据集和1,397,244个修饰位点，与以前的版本相比，扩展了约10倍。
2.8. 甲基化特异性PCR检测p14 DNA甲基化
用MagnetTM DNA MegaPrep1试剂盒提取总DNA。使用AciI酶消化，使之适应于少量DNA (15 ng)。亚硫酸氢盐修饰的DNA用甲基化序列或非甲基化序列的特异引物扩增。用Perkin Elmer 9600进行DNA扩增。对于PCR扩增，在最终体积为30 μl的PCR混合物中加入3 μl亚硫酸氢钠修饰的DNA，该混合物包含3 μl 10 × LA PCR缓冲液、3 μl dNTP混合物(2.5 mM)、1个单位Taq聚合酶和引物(每次反应18 pmol)。PCR扩增均在以下条件下进行：95℃下1个循环5分钟；95℃下35个循环1分钟，退火温度58℃下1分钟，72℃下1分钟。此外，在70℃下进行5分钟的最终延伸。以体外经SSSI甲基化酶处理的细胞DNA作为甲基化等位基因的阳性对照；未经处理的细胞DNA作为非甲基化对照。将PCR产物直接加载到2.5%琼脂糖凝胶上，用50 bp的梯形标记，溴化乙锭染色，紫外可见。
2.9. 统计分析
采用SPSS statistics进行数据分析。分类变量采用数字或者率来表示，连续变量采用平均数 + 标准差表示；连续变量采用组间t检验的方法分析两组间，分类变量采用Fisher’s精确检验，Spearman等级相关性检验YTHDF2与p14在NSCLC组织中表达水平的相关性。统计分析两组指标有无显著性差异及相关性。
3. 结果
3.1. HE染色
收集肺癌患者癌和癌旁组织共44例，HE染色观察组织病理损伤情况，实验分组：癌旁组织、癌组织；(n = 44)，结果见图1。
Figure 1. Hematoxylin-eosin staining
图1. HE染色
3.2. qRT-PCR检测组织YTHDF2、p14表达水平
收集肺癌患者癌和癌旁组织共44例，qRT-PCR检测组织YTHDF2、p14表达水平。实验分组：癌旁组织、癌组织；(n = 44)，结果见图2。结果表明：从定量PCR结果可以看出，与肺癌癌旁组比，基因YTHDF2、p14在癌中的表达显著升高(P < 0.05)。
Figure 2. QRT PCR detection of YTHDF2 and p14 expression levels in tissues
图2. qRT-PCR检测组织YTHDF2、p14表达水平
收集42对NSCLC患者的肿瘤组织和癌旁组织，qRT-PCR检测组织YTHDF2、p14表达水平。根据得出的Ct值分析，ΔCt = 目的基因Ct值 − 内参基因Ct值；ΔΔCt = 肿瘤组织ΔCt平均值 − 癌旁组织ΔCt值平均值；我们把42对标本的YTHDF2的ΔΔCt值与p14的ΔΔCt值做散点图，见图3，并用SPSS statistics分析两目的基因的Spearman等级相关性，见表9。
Figure 3. Dot distribution of YTHDF2 and p14 expression in NSCLC
图3. NSCLC中YTHDF2、p14表达点状分布
Table 9. Spearman correlation analysis of YTHDF2 and p14 expression levels in NSCLC
表9. NSCLC中YTHDF2、p14表达水平的Spearman相关性分析
相关性 |
|
YTHDF2 |
p14 |
Spearman等级相关性分析 |
YTHDF2 |
相关系数 |
1.000 |
0.561 |
P |
. |
<0.001 |
N |
42 |
42 |
p14 |
相关系数 |
0.561 |
1.000 |
P |
<0.001 |
. |
N |
42 |
42 |
根据上表可知YTHDF2和p14之间存在正相关性，相关系数rs = 0.561 (P < 0.001)，即YTHDF2和p14在NSCLC患者肿瘤组织中的表达水平具有正相关性。
3.3. Western Blot检测组织YTHDF2表达水平
收集肺癌患者癌和癌旁组织共44例，Western Blot检测组织YTHDF2表达水平。实验分组：癌旁组织、癌组织；(n = 44)，结果见图4。结果表明：与癌旁组织比，癌组织YTHDF2表达上调(P < 0.001)。
本蛋白印迹实验的灰度分析方法：首先使用ImageJ打开实验图像，将图像转换为灰度模式，使用矩形工具选择目标条带区域(ROI)，在条带附近选择背景区域，测量其灰度值，以扣除背景对信号的影响。通过减去背景灰度值，获得目标条带的净灰度值。
将目标蛋白条带的净灰度值与内参蛋白(GAPDH)的净灰度值相除，得到标准化的相对表达水平。这一步骤有助于消除样品加载量和实验条件的差异。最终，将所有样本的灰度数据整理并导入GraphPad Prism，绘制柱状图或折线图，同时进行统计学检验。确保信号在检测系统的线性范围内，并进行多次重复实验。
Figure 4. Western Blot detection and grayscale analysis
图4. Western Blot检测及灰度分析
3.4. TUNEL染色检测组织细胞凋亡情况
收集NSCLC患者肿瘤组织和癌旁组织共44例，TUNEL染色。实验分组：阳性对照、阴性对照、癌旁组织、肿瘤组织；(n = 44)，结果见图5。由于凋亡的细胞发生DNA断裂，荧光素标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3'-OH末端，经过染色，在荧光显微镜下可以准确定位到凋亡细胞，在红光下呈明显的发光。结果表明：与癌旁组织比，肿瘤组织细胞凋亡水平升高。
3.5. 生信分析
使用RMBase v2.0中的https://rna.sysu.edu.cn/rmbase/m6Amod.php。从结果里面选择靶基因是TET2的结果，可以看到TET2的mRNA上存在大量的m6A位点。
3.6. 甲基化特异性PCR检测p14 DNA甲基化水平
收集肺癌患者癌和癌旁组织各10例，甲基化特异性PCR检测p14 DNA甲基化水平。实验分组：癌旁组织、癌组织；(n = 20)，实验结果见图6。结果显示：从胶图中可以看出，在癌组织中甲基化和非甲基化条带比较，甲基化条带明显较亮；在癌旁组织中甲基化和非甲基化条带比较，甲基化条带不明显。
Figure 5. TUNEL staining
图5. TUNEL染色
Figure 6. Methylation specific PCR detection of p14 DNA methylation and non methylation experimental gel plot (Two are grouped together, with methylation on the left and non methylation on the right)
图6. 甲基化特异性PCR检测p14 DNA甲基化和非甲基化实验胶图(2个为1组，左甲基化，右非甲基化)
(2) 使用PCR定量检测10组样本中p14 DNA甲基化水平，实验结果见图7。
3.7. GEPIA数据库分析NSCLC中YTHDF2、TET2之间的Spearman相关性见图8
结果表明在LUAD中YTHDF2与TET2呈正相关，相关系数R = 0.5；在LUSC中YTHDF2与TET2也呈正相关，相关系数R = 0.48。
Figure 7. PCR quantitative analysis
图7. PCR定量分析
Figure 8. Spearman correlation between YTHDF2 and TET2 in NSCLC (The left image is LUAD, and the right image is LUSC)
图8. NSCLC中YTHDF2和TET2之间的Spearman相关性(左图为LUAD，右图为LUSC)
4. 结论
1) HE染色可见肿瘤组织中病理损伤明显，能明确采集样本的诊断并与癌旁组织区分。TUNEL染色可见：与癌旁组织相比，肿瘤组织细胞凋亡水平升高。
2) qRT-PCR实验结果表明在NSCLC患者的肿瘤组织中YTHDF2和p14基因的表达水平明显高于癌旁组织(P < 0.05)。YTHDF2与p14在NSCLC患者肿瘤组织中的相对表达水平呈正相关(rs = 0.561, P < 0.001)。
3) Western Blot检测组织YTHDF2表达水平发现，与NSCLC患者的癌旁组织相比，肿瘤组织中的YTHDF2表达上调(P < 0.001)。
4) TET2生信分析显示TET2 mRNA上存在大量的m6A位点，且YTHDF2与TET2的表达存在正相关性(LUAD中相关系数R = 0.5，LUSC中R = 0.48)。
甲基化特异性PCR检测p14 DNA甲基化水平，结果表明在NSCLC的肿瘤组织中p14 DNA上存在高甲基化修饰。
5. 讨论
在中国，肺癌是各种恶性肿瘤中发病率和死亡人数最多的一种疾病，其中最常见的肿瘤类型NSCLC严重危害着我国人民的生命健康。已知NSCLC发病原因与患者的吸烟史、家族史、职业暴露和慢性肺部疾病[1]-[4]及不健康的烹饪方式有着密切联系[5]。但NSCLC具体的发病机制仍未明确，对其发病机制的不断探索是我们医学工作者应有的义务。我们课题组通过阅读大量文献和既往多项实验研究提出时代热点m6A与抑癌基因p14之间存在某种分子机制能延缓NSCLC的发生、发展。
m6A作为在DNA或RNA碱基和核糖上的一种化学修饰，能影响其蛋白表达而不改变基因，是表观遗传学的一种[7]，是mRNA的腺苷第6位N原子上发生的甲基化修饰。主要由甲基化转移酶(Writers)、去甲基化酶(Erasers)和甲基化阅读蛋白(Readers)共同发挥作用，是哺乳动物mRNA水平最常见的化学修饰[8]。其中m6A的Writers可以通过对mRNA m6A水平的调控促进mRNA对应基因的翻译和降解[9] [10]。Erasers可以控制和修整细胞的各种过程，其主要成员ALKBH5和FTO可以可逆性去除由甲基转移酶介导的m6A甲基化[11]。Readers可以通过调节具有m6A修饰的mRNA稳定性即参与mRNA转录、mRNA剪接、mRNA结构及mRNA翻译效率等过程控制基因的表达[11]。
本课题组主要研究的蛋白YTHDF2属于m6A阅读蛋白的一种，主要由C端的YTH结构域组成，对富含G (m6A)C结构的m6A mRNA能更好地识别[12] [13]。以往研究表明了YTHDF2参与眼部黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌以及NSCLC等各种恶性肿瘤的进展，同时提高NSCLC患者的OS、RFS，且YTHDF2的表达随着NSCLC的进展会逐渐降低，在晚期患者中YTHDF2的表达水平明显低于早期患者[14]。滕等人通过细胞学和分子生物学实验验证了YTHDF2在NSCLC组织中的表达增加，且YTHDF2的高表达能延长患者总生存周期，并可以通过信号通路抑制LUAD的在体内的侵袭和转移[15]。侯等人研究发现YTHDF2的SUMO化可以使其对m6A修饰的mRNA亲和力增加并调节基因转录后表达和促进癌症的进展，且与肺癌的关系密切[16]。以上皆提示YTHDF2与NSCLC关系十分密切，YTHDF2在NSCLC预后中发挥着重要作用。本课题对临床上22名NSCLC患者的肿瘤组织和癌旁组织进行HE染色观察以确保样本的病理损伤和样本采集的精准，根据HE染色结果分析22例肿瘤组织中20例为浸润性腺癌，2例为微浸润性腺癌，癌旁组织未见明显异常，NSCLC诊断明确，染色结果如图1所示。同时，进行TUNEL染色可见与癌旁组织相比，肿瘤组织细胞凋亡水平明显升高(如图5所示)。对上述染色明确组织形态的44个样本进行qRT-PCR检测YTHDF2表达水平，根据相对定量分析F = 2−ΔΔCt，如图2所示，肿瘤组织中YTHDF2表达水平较高(P < 0.05)。同时对这22名NSCLC患者的肿瘤组织和癌旁组织进行了Western Blot检测及灰度分析，根据YTHDF2在肿瘤组织与癌旁组织中表达水平的比较，得到了与qRT-PCR相同的结论。如图4所示，与癌旁组织相比，肿瘤组织中的YTHDF2表达水平显著上调(P < 0.001)。
本课题第二个关键蛋白TET2作为双加氧酶的一种，具有氧化功能，其在哺乳动物中，能使在5mC氧化产生5hmC、5fC和5caC [17] [18]。TET2能在富含G(m6A)C的结构中发挥其去甲基化的作用，且具有介导活性DNA去甲基化的生物学功能[17]。TET2在我们造血系统的恶性肿瘤中发挥着重要作用[18]-[21]，且与肾细胞癌、食管癌、卵巢癌等上皮组织恶性肿瘤的进展存在密切联系。本课题根据YTHDF2在肝癌组织中能特异性识别OCT4 mRNA的5'-UTR甲基化位点，并促进OCT4 mRNA的翻译及其蛋白的表达[22]，生信分析发现TET2 mRNA上存在大量m6A甲基化位点(图6)，同时GEPIA数据库分析发现YTHDF2与TET2在NSCLC中的表达呈正相关，合理推断YTHDF2能通过特异性识别TET2 mRNA 5'-UTR的m6A位点，使TET2的蛋白表达增加。我们课题组既往对104对临床样本肿瘤组织和癌旁组织的免疫组化检测，再次验证了YTHDF2和TET2之间存在正相关性，同时表明YTHDF2和TET2与NSCLC患者的临床病理特征之间存在密切联系。
由CDKN2A编码的p14ARF作为人体内的肿瘤抑制因子，可以阻止RAS和MYC等致癌信号在体内引发的信号传导，从而保护正常细胞和阻止异常细胞的增殖，起到抑制肿瘤进展的作用[23]。p14ARF能通过结合MDM2，阻止MDM2在细胞中对p53的降解，并稳定p53基因和增加p53蛋白的表达[24]，而肿瘤抑制基因p53在各种恶性肿瘤的发生发展中起到了关键抑制作用[25]。研究表明在多种恶性肿瘤组织中，包括p14在内的肿瘤抑制基因，其启动子和增强子区域的CpG岛上常常存在高甲基化修饰，且研究人员认为启动子区域的高甲基化有促进肿瘤的增殖和侵袭的作用[26]。杨等人通过625例肺肿瘤组织和488例正常组织样本进行meta分析发现，在NSCLC中，p14启动子区域的甲基化程度明显高于对照组织[27]。我们课题组既往通过NMSP对SPCA1细胞中p14启动子区域甲基化程度检测，验证p14启动子区域存在异常的甲基化[28]。本课题通过对44个HE染色样本中10对肿瘤组织和癌旁组织进行了甲基化特异性PCR检测p14 DNA甲基化水平，并对结果进行了PCR定量分析(图8)，可以从图7中看到肿瘤组织中甲基化和非甲基化条带相比，甲基化条带明显较亮，再次表明NSCLC患者的肿瘤组织中p14 DNA存在高甲基化修饰。
既往一项meta分析的研究表明在NSCLC III、IV期患者的肿瘤组织中发现p14ARF表达明显低于I、II期的早期患者[29]，类似于YTHDF2在晚期NSCLC患者中的表达要低于早期患者，可见YTHDF2与抑癌基因p14在NSCLC肿瘤组织中的表达有着相似特征。如图2所示，YTHDF2和p14在NSCLC组织中皆存在高表达，且本课题通过对42名临床确诊NSCLC患者的肿瘤组织和癌旁组织进行qRT-PCR检测YTHDF2、p14在肿瘤组织中的相对表达水平并做散点图(图3)，同时用SPSS statistics进行Spearman等级相关性数据分析发现YTHDF2和p14在NSCLC组织中的相对表达水平明确存在正相关性(见表9，相关系数rs = 0.561，P < 0.001)。
既往研究人员发现在肾细胞癌中发现IRF1启动子区域存在高甲基化，TET2在肾细胞癌中的生物学活性增加能使IRF1启动子区域发生去甲基化，从而IRF1表达水平增高而达到抑制肾细胞癌发生发展的作用。而在食管癌和卵巢癌中，TET2均表现为一个低表达状态，研究人员通过不同的信号通路使TET2表达增加可以有效的抑制食管癌或卵巢癌的增殖、侵袭和迁移功能。表明TET2能在各种恶性肿瘤中发挥其去甲基化功能，达到延缓肿瘤进展和改善其预后的作用。因此，本课题根据科学逻辑合理推断在NSCLC中，TET2也能发挥其去甲基化的作用，使p14启动子区域高甲基化的GpC岛发生去甲基化，从而促进抑癌因子p14ARF的表达，发挥其抑制肿瘤发生、发展的作用。
关于本实验中YTHDF2和p14ARF在NSCLC中出现的高表达现象，既往研究[30]结果支持NSCLC中YTHDF2表达被上调，该实验认为YTHDF2通过调节相关途径抑制肺癌细胞的迁移和入侵，以此在肺癌转移中发挥重要作用。有关p14ARF的研究不多，青岛大学的一项实验结果[31]与本实验结果类似，该实验结果证实存在p14ARF在肺肿瘤早期表达增强现象。
综上所述，本课题的研究证实：m6A的阅读蛋白之一YTHDF2能通过识别TET2 mRNA 5'-UTR的m6A位点，使TET2的表达增加，从而发挥其去甲基化的作用，使p14启动子高甲基化区域发生去甲基化，促进抑癌因子p14ARF的表达增加，最终延缓NSCLC的进展，改善NSCLC患者的预后。本课题首次将研究热点m6A与抑癌基因p14联系起来，并根据相关文献和实验结果作出合理推测，表明了m6A阅读蛋白YTHDF2通过什么样的途径与p14产生联系，从而抑制NSCLC的发生、发展。并且本课题首次通过qRT-PCR实验明确了在NSCLC组织中YTHDF2和p14的表达存在正相关性(表9)。不足之处在于本课题只表明了在NSCLC中YTHDF2和TET2之间存在正相关，且生信分析了TET2的mRNA上存在大量的m6A位点，并未用RNA甲基化免疫沉淀与qRT-PCR (MeRIP-qPCR)检测证明基因TET2 mRNA的m6A水平。并且我们在证明NSCLC中YTHDF2与TET2表达水平呈正相关、YTHDF2与p14表达水平呈正相关(表9)结论的同时，我们并没有实验或数据支撑TET2与p14之间的联系，仅是逻辑推断。后续我们课题组会根据本课题的理论和实验支撑进行体外细胞实验和基因敲除实验，充分证明YTHDF2、TET2和p14之间存在的相关联系。在NSCLC发生及进展的分子机制尚不完全明确的今天，间接限制了NSCLC治疗效果的进一步提高。因此，本课题从深入探究NSCLC的病理和发病机制出发，进行多项实验并分析了YTHDF2在NSCLC发生、发展中的重要性，具有重要的临床价值和理论意义。
NOTES
*通讯作者。