1. 引言

荧光免疫层析法(Fluorescence immunochromatography Assay, FICA)结合了色谱测定以及抗原和抗体的特异性反应[1]。以生物标志物为示踪剂，可以通过光学仪器直接或间接实现分析物的定量检测。由于其高灵敏度和快速检测速度，FICA已广泛应用于环境[2]、医学[3]和食品安全检测[4]。

近年来，随着即时检测(POCT)的快速发展，FICA阅读器的发展已朝着小型化、移动化和智能化发展[5]。目前，大多数FICA条带阅读器都基于光电扫描方法[6] [7]。尽管这些读数仪具有很高的准确性和稳定性，但在检测之前必须定位试纸的位置。与光电式FICA条带阅读器相比，图像FICA条带阅读器无需步进电机和模拟信号处理电路，因此具有结构简单、体积小等优点[8] [9]。

目前，基于智能手机的便携式检测技术已成为生物传感器检测领域的热点[10] [11]，手机的CMOS图像传感器可用于提高图像FICA条带读取器的检测精度。由于传统的试纸检测只能提供定性结果，而定量检测对于疾病信息的判断是迫切需要的，因此智能手机作为试纸的定量分析工具也成为研究人员关注的焦点[12] [13]。这种应用不仅可以大大降低检测成本，而且更有利于家庭式自我检测的推广和应用。

根据荧光图像的特点，本文开发了一种基于MATLAB实现荧光图像定量检测的成像系统。该系统采用智能手机CMOS图像传感器采集荧光试条图像信息，通过MATLAB对试纸荧光图像进行高斯滤波去除背景噪声，执行背景减法，计算出检测线和质控线的荧光曲线峰值，最后根据荧光图像的特征值，实现对试纸条样本浓度的定量检测。本研究的荧光免疫层析试条成像检测系统的重复性好，CV < 3.2%，拟合出的标准曲线的R²可达0.999，实现了快速定量化检测。

2. 实现方法

2.1. 定量检测系统

免疫层析法(FICA)是一种用于定量分析的膜检测技术，通常用于检测具有多种抗原决定簇(蛋白质、病毒和病原菌)的大分子抗原。免疫层析试纸主要由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组成，免疫层析反应在试纸条的硝酸纤维素膜上进行。当分析物浓度较高时，T线上富集的荧光颗粒越多，因此T线的荧光强度更强。但是，用于验证试纸有效性的C线的荧光强度没有变化[14]，因此可根据试纸的特性值进行定量分析。

在激发光源照射下，试纸条的T线和C线的荧光强度与T线和C线上的荧光颗粒浓度呈线性关系。在测试过程中，同一试纸的T线和C线用相同的荧光标记标记。因此，试纸的特性值(t)由下式给出：

$\begin{array}{c}t=\frac{F_T}{F_C}\end{array}$ (1)

其中 $F_T$ 和 $F_C$ 分别表示T线和C线上荧光强度。因此，对于图像分析方法，可以通过计算T线与C线的荧光强度比值来获得试纸的特性值。特征值与待测溶液浓度成正比，将得到的结果与拟合标准曲线进行对比，即可得到样本溶液的浓度值，达到定量检测的功能。

由于本工作中的研究是基于FluA试纸条图像的荧光信号，为了避免外部环境光对定量检测的干扰，将充分反应后的荧光免疫层析试条放入紫外检测仪中检测。在激发光源的照射下发出荧光，通过手机摄像头采集荧光试条图像信息，并将其传输给Matlab R202a软件进行图像处理。实验结果由智能手机小米记录、处理和显示，总体组成结构如图1所示：

Figure 1. Structure of quantitative detection system

图1. 定量检测系统组成结构

Figure 2. Acquisition system for fluorescence immunochromatographic detection

图2. 荧光免疫层析检测的采集系统

荧光免疫层析图像采集系统如图2所示，它由荧光试纸条、智能手机，发光二极管(5W UV LED)、窄带滤光片(615 nm半峰全宽30 nm)组成。光路结构采用双向斜射式检测系统，保证激发光源能够均匀照射荧光免疫层析试条。激发光源照射在C线和T线上，产生波长为625 nm的荧光信号，经过滤波片被智能手机摄像头捕捉，传输到图像处理软件。

2.2. 算法处理

图像处理软件接收到从智能手机传过来的荧光试条图像，对图像进行处理，处理过程如图3所示。

Figure 3. Test strip image processing flow

图3. 试纸条图像处理流程

Figure 4. Fluorescence immunochromatographic image RGB signal channel 3D diagram

图4. 荧光免疫层析图像RGB信号通道三维图

对于试纸条图像(常见的彩色图像数据存储格式如RGB，每个像素点由红、绿、蓝三个通道的颜色值构成)特点，应选取合适的RGB通道分析其图像的荧光信息。图4(a)为试条图像，图4(b)是以(a)图的行、列以及红色像素值为x，y，z轴的三维图像；图4(c)是以(a)图的行、列以及绿色像素值为x，y，z轴的三维图像；图4(d)是以(a)图的行、列以及蓝色像素值为x，y，z轴的三维图像。图4中(b)图最能反映出试条图像的荧光信息，所以本文对于试纸条图像选择提取红色通道进行图像处理。

智能手机在采集图像信号的过程中因环境等因素会出现噪声，这些噪声对检测结果会造成不利影响，导致出现误差。因此在试纸条图像定量分析之前，必须对原始图像信号进行滤除噪声的处理。鉴于试条C线和T线分别在试纸条的两侧，本文利用高斯滤波处理图像。高斯滤波器的二维离散形式可以表示为：

$\begin{array}{c}G\left(x,y\right)=\frac{1}{2\pi {\sigma }^2}{\text{e}}^{-\frac{x^2+y^2}{2{\sigma }^2}}\end{array}$ (2)

其中， $\left(x,y\right)$ 表示滤波器中像素点相对于中心像素点的坐标位置， $\sigma$ 是高斯滤波器的标准差。是对上述连续的二维高斯函数在离散的像素区域内进行采样和归一化得到的离散滤波器矩阵gaussianFilter。对于图像 $I\left(x,y\right)$ (这里对应提取的红色通道图像)进行高斯平滑，用创建好的离散高斯滤波器与之进行卷积操作，用公式表示为：

$\begin{array}{c}Sx,y=\underset{m=-k}{\overset{k}{{\displaystyle \sum }}}\underset{n=-k}{\overset{k}{{\displaystyle \sum }}}I\left(x+m,y+n\right)\times \text{gaussianFilter}\left(m+k+1,n+k+1\right)\end{array}$ (3)

其中， $S\left(x,y\right)$ 表示高斯平滑后的图像， $k$ 是滤波器尺寸的一半。

荧光免疫图像的荧光区域不仅含有荧光信号，还含有背景信号，所以在计算特征值前必须将背景信号滤除。对于背景噪声，选取图像边缘区域作为背景估计，以顶部区域为例，假设图像高度为H，宽度为W，选取h行作为背景估计区域，该区域的像素矩阵可以表示为 $B_{top}\left(i,j\right)$ ( $i=1,2,\cdots ,h$ , $j=1,2,\cdots ,W$ )，将四个边缘区域(顶部 $B_{\text{top}}$ 、底部 $B_{\text{bottom}}$ 、左侧 $B_{\text{left}}$ 、右侧 $B_{\text{right}}$ )合并成一个向量来估计背景，合并后的向量backgroundEstimate的元素就是把这些区域的像素值依次排列在一起，其均值(即背景噪声估计值backgroundNoise)计算公式为：

$\begin{array}{c}\text{backgroundNoise}=\frac{1}{n}\underset{i=1}{\overset{N}{{\displaystyle \sum }}}\text{backgroundEstimate}\left(i\right)\end{array}$ (4)

其中N是backgroundEstimate向量中元素的总数，也就是四个边缘区域像素值的总数之和。

从经过高斯平滑后的图像 $S\left(x,y\right)$ 中减去背景噪声估计值backgroundNoise，得到去除背景噪声后的图像 $R\left(x,y\right)$ ，用公式表示为：

$\begin{array}{c}R\left(x,y\right)=S\left(x,y\right)-\text{backgroundNoise}\end{array}$ (5)

沿着图像的列方向(对应试纸条的长度方向)生成荧光曲线，对去除背景噪声后的图像 $R\left(x,y\right)$ 的每一列像素值进行求和操作来得到荧光曲线的数据 $F\left(c\right)$ ，其中 $c$ 表示列索引，计算公式为：

$\begin{array}{c}Fc=\underset{r=1}{\overset{H}{{\displaystyle \sum }}}R\left(r,c\right)\end{array}$ (6)

将所提图像处理算法的分析结果作为定量检测结果的依据。算法处理图4(a)结果如图5所示。通过滤除图像背景信号，进行有效地基线校正，可以更准确地识别和量化信号，提高了分析结果的准确性和可靠性，使得荧光信号的峰值位置和峰形更加清晰，便于后续的峰值检测和定量分析。

Figure 5. Test strip image fluorescence signal waveform

图5. 试纸条图像荧光信号波形图

3. 数据分析结果

3.1. 重复性

重复性原则是科学研究最重要的标准之一。一般情况下，科学实验的研究应当是可重复的，这意味着实验结果具有客观性。分别选取200 ng/mL、100 ng/mL和50 ng/mL三种浓度FluA荧光免疫层析试条作为检测试条。使用该算法检测三种不同浓度的试纸条图像，并进行5次重复检测，并将实验数据记录下来，特征值见表1。

Table 1. Results of Flu A fluorescence test strip

表1. Flu A荧光试条检测结果

表中采用变异系数(CV)作为仪器重复性的评判标准

$\begin{array}{c}\text{CV}=\frac{\sigma \left(X\right)}{E\left(X\right)}\times 100\%\end{array}$ (7)

式中， $\sigma \left(X\right)$ 表示测试数据的标准差， $E\left(X\right)$ 表示测试数据的平均值。从表1可以看出，检测结果CV值小于3.2%。测量结果表明，在高浓度下的重复性可以更好，低浓度的重复性相对较差。但总体来看，该检测系统具有良好的重复性，满足系统的检测要求。

3.2. 测量结果的数据分析

为了验证该系统的准确性，同时探究了不同浓度的Flu A标准溶液(0~300 ng/mL)的试纸条图像特征值与浓度间的关系。如图6所示，为不同Flu A浓度下试纸条的特征值。

Figure 6. Characteristic values of test strips at different concentrations of Flu A

图6. 不同Flu A浓度下试纸条的特征值

Figure 7. Standard curves of characteristic values and concentrations of Flu A at different concentrations

图7. 不同Flu A浓度下特征值和浓度的标准曲线

由于四参数Logistic拟合法在绘制化学荧光免疫分析标准曲线时的效果较好，所以采用四参数拟合法绘制浓度标准曲线。对特征值与Flu A浓度之间进行Logistic四参数拟合，如图7所示，拟合曲线相关系数R² = 0.999，表明该系统对样本数据具有很强的解释力。这些结果表明，该系统具有良好的预测性能和较高的可靠性。这些发现进一步验证了拟合模型对样本数据的适应性和准确性，为数据分析提供了可靠的基础。

4. 结论

本文提出了一种基于MATLAB的荧光试纸成像检测系统。利用智能手机CMOS图像传感器采集荧光试条图像信息，通过计算试纸荧光图像T线与C线峰值的比值，可以快速准确地实现荧光试纸Flu A浓度的测量。由实验结果可知，本文提出的成像检测系统对试纸图像特征值和浓度的标准曲线的拟合程度可达0.999，在5组重复性测量实验中，变异系数均小于3.2%，表明系统的重复性很好，满足实际应用需求。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。

参考文献