摘要: 目的：模拟现场快速FOB检测筛选后的阳性结果试纸条，探索阳性FOB试纸条用于DNA检测的可行性以及DNA检测的最佳区域。为此类案件后续的DNA检测提供新的实验思路，为侦查提供方向和线索。方法：以模拟现场快速FOB检测的10份阳性FOB试纸条(6男4女)为研究对象，将试纸条分为3个不同区域(A加样区，B反应区，C检测线)，选用Chelex-100法对不同分区样本进行DNA的提取，用VFP (AB公司)试剂盒进行PCR扩增，用AB公司的3500 xl进行电泳，并且选用GeneMapper ID-X 1.5软件进行STR分型。通过直接计数法统计不同区域STR分型的得分情况，并且通过非参数检验的方法Kruskal-Wallis检验进行组间数据分析。结果：10份阳性FOB试纸条(6男4女)的3个不同区域不同程度地检测出来了人体特异性STR分型，三个区域得分如下：A区域最高得分43分、最低得分12分、平均得分21.4分；B区域最高得分50分、最低得分46分、平均得分48.9分；C区域最高得分14分、最低得分1分、平均得分7.8分；通过Kruskal-Wallis检验进行组间比较，得到P值为<0.05。结论：通过本次对10份阳性FOB试纸条的不同区域DNA检测表明：现场快速FOB检测阳性结果的试纸条可以成为犯罪现场一种新型的重要生物检材用于法医DNA分型，3个不同区域中A、B区(反应区)均能得到较好的DNA检测结果，以B区检测效果最佳。
Abstract: Objective: To explore the feasibility of positive FOB test strip for DNA detection and the optimal region of DNA detection by simulating the positive test strip screened by on-site rapid FOB detection. It provides new experimental ideas for the subsequent DNA detection of such cases, and provides direction and clues for investigation. Methods: Ten positive FOB test strips (6 males and 4 females) simulated on-site rapid FOB detection were used as the research objects. The test strips were divided into three different regions (A sampling area, B reaction area, C detection line). Chelex-100 method was used to extract DNA from samples in different regions. PCR amplification was performed with VFP (AB) kit, electrophoresis was performed with 3500 xl of AB company, and STR typing was performed using GeneMapper ID-X 1.5 software. The scores of STR typing in different regions were counted by direct counting method, and the data between groups were analyzed by Kruskal-Wallis test. Results: Human-specific STR typing was detected in three different regions of 10 positive FOB test strips (6 males and 4 females) to varying degrees. The scores of the three regions were as follows: the highest score of A region was 43 points, the lowest score was 12 points, and the average score was 21.4 points. The highest score of area B was 50 points, the lowest score was 46 points, and the average score was 48.9 points. The highest score of region C was 14 points, the lowest score was 1 point, and the average score was 7.8 points. The Kruskal-Wallis test was used for comparison between groups, and the P value was < 0.05. Conclusion: The DNA detection of different regions of 10 positive FOB test strips showed that the test strips with positive results of rapid FOB detection on site can become a new type of important biological samples for forensic DNA typing at the crime scene. In the three different regions, the A and B regions (reaction regions) can obtain better DNA detection results, and the B region has the best detection effect.
1. 引言
血迹是凶杀、伤害等案件中最常见和最重要的物证[1]，明确的血迹痕迹有助于对现场进行快速辨认并提供侦查方向[2]。但在实际的现场勘查中，由于人为因素和环境因素的影响，血迹往往难以辨认，易与现场中其他形态相似的物质混淆。因此对血痕进行种属鉴定能为侦查提供方向并为后续的个体识别提供坚实基础，在法医物证检验中具有重要的意义[3]。
抗人血红蛋白免疫胶体金试纸条(简称FOB试纸条)结合了免疫胶体金与人血红蛋白及其特异性抗体的反应特性，因其具有灵敏性、简易性、快速性的特点，被广泛运用于目前的血痕种属实验中[4]-[6]。法医物证本身具有易降解、微量、受环境影响大的特点，同时因为保存与运输等不确定因素往往会导致一些人体血痕检材被影响而不能得到高效检测[7]，在实践中FOB试纸条在得到有效的实验结果后便被直接丢弃，这降低了对生物物证的利用率，因此本研究目的在于探究阳性FOB试纸条能否成为一种新型的法医生物物证用于实践DNA检测，为法医学实践生物物证提供一种重要的补充和新可能。
2. 材料与方法
2.1. 样本
收集6名男性、4名女性共10名志愿者每人1 mL的新鲜血液。
2.2. 仪器和试剂
抗人血红蛋白胶体金试纸条(FOB试纸条)、采血卡、无菌水、蛋白酶K、Chelex-100溶液、VFP (verifiler PLUS)试剂盒、甲酰胺；PCR扩增仪(ABI 9700)、3500 xl遗传分析仪(Applied BiosystemsTM公司)。
2.3. 实验方法
2.3.1. 模拟现场快速筛选阳性FOB试纸条准备
10份血液各取10 μL加入EP管中，加入100 μL灭菌水震荡混匀并且进行标记(1~10号)模拟现场血液可能存在的稀释情况。按照使用说明在EP管中分别插入FOB试纸条，3~5 min后观察检测结果确认其结果为阳性结果。将十个样本分别剪取如图1所示的A、B、C三个区域并加入EP管中并且标记为1A、1B、1C、2A、2B、2C、3A、3B、3C、4A、4B、4C、4A、4B、4C、5A、5B、5C、6A、6B、6C、7A、7B、7C、8A、8B、8C、9A、9B、9C、10A、10B、10C。
Figure 1. FOB test strip structure diagram and partition situation
图1. FOB试纸条结构及分区情况图
2.3.2. 标准样品的制备
1~10号血液样品各取200 μL滴加在采血卡上，在阴凉处自然干燥制备成血卡，使用打孔器打孔取样4孔(直径1 mm)置于EP管作为对照组，分别标记为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
2.3.3. DNA提取
将标记了1A~10C的30个EP管作为实验组，并且将其对应的1~10号血液样本作为对照组。依次在含有检材的40个EP管中加入200 μL的5% Chelex-100溶液、10 μL的蛋白酶K，震荡混匀后56℃水浴加热2小时。取出后振荡，100℃煮沸10 min，使用高速离心机13,000 rpm/min离心5 min，离心后取上清液置于4℃保存。
2.3.4. PCR扩增
选用VFP (verifiler PLUS)试剂盒对D3S1358、vWA、D16S539、CSF1PO、D6S1043、Yindel、AMEL、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D2S441、D19S433、FGA、D10S1248、D22S1045、D1S1656、D13S317、D7S820、Penta E、PentaD、TH01、D12S391、D2S1338、TPOX共二十五个基因座进行PCR复合扩增，使用10 μL体系扩增(无菌水:Master Mix:Primer Pair Mix:扩增模板 = 6:2:1:1)，同时设立灭菌纯水为阴性对照样本，2800 M为阳性对照样本，离心2 min。离心后放入PCR扩增仪中，选择VFP29程序进行扩增，程序具体如下：① 95℃，1 min；② 96℃，10 s后62℃，1 min 30 s循环2次；③ 96℃，10 s后59℃，1 min 30 s循环27次；④ 60℃，5 min；⑤ 4℃保存。
2.3.5. 电泳与数据分析
在96孔板分别加人liz600 9 μL (1000:20)扩增产物1 μL，最后在板内分别加人liz600 9 μL (1000:20)，阴性对照1 μL；liz600 9 Μl (1000:20)，LD 1 μL；离心2 min。选用3500 xl进行电泳，选择VFP试剂盒VFP29扩增程序对应的电泳程序进行电泳。经GeneMapper ID-X 1.5软件分析得到STR分型结果。分析方法为VFP-0322，分析片段组为VFP_Panels_0322，内标为GS600_LIZ + Normalization_(60-460)。
2.4. 统计方法
使用直接计数法对实验结果进行计分，将阳性FOB试纸条三个区域的STR分型结果分别与标准样品的STR分型结果进行比对，一个位点为2分共50分。以一个基因位点为例，对比标准样品的与阳性FOB试纸条的STR分型，当二者分型全相同时计2分，半相同时计1分，全不同时计0分。得到得分后用Kruskal-Wallis 检验进行各区域组间数据分析。
3. 结果
3.1. STR峰型图谱
以一个样本为例，样本及其A、B、C三个区域D3S1358、vWA、D16S539、CSF1PO、D6S1043五个基因组位点的STR分型见图2~5。
Figure 2. Partial STR typing results of standard samples
图2. 标准样本部分STR分型结果图
Figure 3. Partial STR typing results of the A region of the positive FOB test strip sample
图3. 阳性FOB试纸条样本A区域的部分STR分型结果图
Figure 4. Partial STR typing results of the B region of the positive FOB test strip sample
图4. 阳性FOB试纸条样本B区域的部分STR分型结果图
Figure 5. Partial STR typing results of the C region of the positive FOB test strip sample
图5. 阳性FOB试纸条样本C区域的部分STR分型结果图
3.2. STR分型结果
列举1号和2号样本的标准分型以及各自样本A、B、C三个区域的25个基因座分型结果，结果见表1：
Table 1. STR typing results of No. 1 and No. 2 samples
表1. 1号和2号样本的STR分型结果表
基因座 |
1号样本 |
2号样本 |
标准分型 |
1A |
1B |
1C |
标准分型 |
2A |
2B |
2C |
D3S1358 |
15 |
15 |
15 |
15 |
15, 16 |
15 |
15, 16 |
15 |
vWA |
16, 18 |
14, 16 |
16, 18 |
14 |
14, 16 |
- |
14, 16 |
14 |
D16S539 |
11, 13 |
- |
11, 13 |
- |
11, 12 |
11 |
11, 12 |
- |
CSF1PO |
10 |
12 |
10 |
- |
12 |
- |
10, 12 |
- |
D6S1043 |
11, 19 |
- |
11, 19.2 |
- |
13 |
- |
11, 13 |
- |
Yindel |
1 |
- |
1 |
1 |
- |
- |
- |
- |
AMEL |
X, Y |
X, Y |
X, Y |
X, Y |
X |
X |
X |
X |
D8S1179 |
14, 15 |
14, 15 |
14, 15 |
13 |
12, 14 |
12, 14 |
12, 14 |
- |
D21S11 |
30, 32.2 |
32.2 |
30, 32.2 |
- |
29, 31.2 |
29, 31.2 |
29, 31.2 |
31.2 |
D18S51 |
13, 15 |
15 |
13, 15 |
- |
14, 15 |
15 |
14, 15 |
- |
D5S818 |
12, 13 |
- |
12, 13 |
- |
11, 12 |
- |
11, 12 |
- |
D2S441 |
10, 11 |
11 |
10, 11 |
10, 11 |
11, 14 |
11 |
11, 14 |
- |
D19S433 |
15.2, 16 |
14, 16.2 |
15.2, 16 |
- |
13, 13.2 |
13 |
13, 13.2 |
- |
FGA |
19, 25 |
22 |
19, 25 |
- |
18, 25 |
25 |
18, 25 |
22 |
D10S1248 |
13, 14 |
13 |
13, 14 |
- |
13, 15 |
- |
13, 15 |
- |
D22S1045 |
11, 15 |
15, 16 |
11, 15 |
11, 15 |
15 |
15 |
15 |
- |
D1S1656 |
15, 17 |
17 |
15, 17 |
15 |
16, 17.3 |
16 |
16, 17.3 |
- |
D13S317 |
8, 9 |
8 |
8, 9 |
- |
8, 11 |
8 |
11, 8 |
- |
D7S820 |
10, 11 |
10 |
10, 11 |
- |
8 |
8 |
8 |
- |
Penta E |
11, 20 |
16 |
11, 20 |
- |
11, 13 |
13 |
11, 13 |
- |
Penta D |
9, 12 |
9, 11 |
9, 12 |
9, 12 |
9 |
- |
9 |
9 |
TH01 |
6, 7 |
9 |
6, 7 |
6 |
9 |
9 |
9 |
9 |
D12S391 |
17, 20 |
15, 21 |
17, 20 |
- |
21 |
21 |
21 |
- |
D2S1338 |
18, 23 |
19 |
18, 23 |
- |
20, 24 |
20 |
20, 24 |
- |
TPOX |
8 |
8 |
8 |
- |
8 |
- |
8 |
- |
3.3. 各样本不同区域得分结果
通过直接计数法计算各样本A、B、C三个区域的得分，得分结果见表2：
Table 2. Score results of different regions of each sample
表2. 各样本不同区域得分结果表
样本编号 |
A区域得分 |
B区域得分 |
C区域得分 |
1 |
18 |
49 |
14 |
2 |
24 |
46 |
9 |
3 |
43 |
50 |
11 |
4 |
22 |
50 |
5 |
5 |
25 |
50 |
6 |
6 |
22 |
48 |
11 |
7 |
16 |
48 |
1 |
8 |
19 |
50 |
3 |
9 |
13 |
50 |
6 |
10 |
12 |
48 |
12 |
3.4. 统计学分析结果
Table 3. Pairwise comparison results of Dunn test
表3. Dunn检验的成对比较结果表
区域比对 |
检验统计量 |
标准误 |
标准检验统计量 |
显著性 |
校正后的显著性 |
C-A |
9.500 |
3.925 |
2.421 |
0.015 |
0.046 |
C-B |
19.750 |
3.925 |
5.032 |
0.000 |
0.000 |
A-B |
−10.250 |
3.925 |
−2.612 |
0.009 |
0.009 |
Figure 6. The scatter plot of the scores of the three regions A, B and C
图6. A、B、C三个区域得分情况的散点图
本次实验的10份阳性FOB试纸条(6男4女)的3个区域不同程度地检测出来了人体特异性STR分型，通过直接计数法统计不同区域STR分型的得分情况。三个区域得分如下：A区域最高得分43分、最低得分12分、平均得分21.4分；B区域最高得分50分、最低得分46分、平均得分48.9分；C区域最高得分14分、最低得分1分、平均得分7.8分，得分分布情况如图6；通过对数据进行正态性检验发现，数据不符合正态分布，因此采用Kruskal-Wallis H检验评估不同区域(A、B、C)得分的分布是否存在显著差异。检验结果显示，Kruskal-Wallis H值为25.335，自由度为2，对应的显著性水平为P < 0.001，因此我们拒绝原假设，认为至少有两个区域的得分分布存在显著差异。为了进一步探究具体哪些区域之间存在显著差异，我们进行了Dunn检验，并采用Bonferroni方法对多重比较的显著性水平进行了校正。检验结果表明，区域C与区域A (校正后P = 0.046)、区域C与区域B (校正后P = 0.000)以及区域A与区域B (校正后P = 0.027)之间的得分差异均达到了统计学显著性水平，结果见表3。
4. 讨论
阳性FOB试纸条用于DNA检测的意义
法医物证在案件侦破中极为关键，它通过分析现场痕迹和物品，为侦查提供线索，明确犯罪事实，并为法庭审判提供科学依据[8]。但由于法医物证本身微量和易降解性特性、案件类型的多样性和犯罪现场的复杂性给法医学实践带来了很多的不确定性和挑战，同时由于法医物证检材不可避免地会在发现、包装、保存和送检过程中受到环境和人为因素的二次影响[9]。以血迹痕迹为例，作为法医学实践中最为常见和复杂的生物物证，任何不当的提取方法和保存运输条件都可能对检材造成再次破坏，导致检测效率降低，进而影响案件侦破效率。目前，降解、微量的血迹痕迹是法医物证检验中的难题，任何一点包含生物信息的检材都至关重要，因此本研究发现，用于现场快速筛查的阳性FOB试纸条也能进行法医DNA检测，成为一种新型重要生物物证，是法医生物物证的重要补充，从而提高了法医生物物证的证据效能。
随着DNA检测技术不断发展，DNA检测的灵敏度不断提高，使得许多微量DNA检材的成功分型成为一种可能[10]，同时DNA检测灵敏度的提高为阳性FOB试纸条用于法医STR分型提供了新希望。在实验中，采用了法医实践中常用的Chlexe-100法提取样本DNA，FOB试纸条A、B区均能得到较好的STR分型结果，其中B区STR分型结果最佳。基于以上结果，我们认为在实践中使用其它更为高效的微量DNA提取方法同样能提取到现场快速筛查的阳性FOB试纸条的DNA并进行成功STR分型，比如磁珠法、硅膜法和自动化提取工作站。
在现场发现可疑血痕时，使用FOB试纸条进行种属鉴别和快速筛查能为侦查提供方向，此时检材部分人体生物信息被固定在FOB试纸条的吸附区和反应区，减少了如腐殖酸等物质对检材的降解与破坏以及保存运输过程对生物物证的影响，因此将阳性的FOB试纸条作为一种新的生物检材进行保存并送检，能提高生物检材的利用效率、DNA检出率和数据库的比对效率。
5. 结论
通过本次对模拟现场快速FOB检测10份阳性FOB试纸条不同区域DNA检测表明：犯罪现场快速FOB检测阳性结果的试纸条可以成为一种新型生物检材用于法医实践STR分型，3个不同区域中B区(反应区)的STR分型效果最佳，为法医学实践个人识别和亲子鉴定提供强有力的技术支撑。
基金项目
上海市法医学重点实验室暨司法部司法鉴定重点实验室开放课题(项目编号：KF202309)。
NOTES
*黄仁武和曾逸飞对本文有同等贡献。
#通讯作者。