1. 引言
连翘叶是木犀科植物连翘的叶片，《中华本草》中记载“连翘茎叶，味苦，性寒”[1]。连翘叶不仅是药材，而且是新食品原料[2] [3]，富含有黄酮、连翘叶蛋白、多糖等活性物质，具有良好的抗氧化[4]、降血脂[5]、消炎[6]、抗疲劳[7]等作用。在食品加工方面，连翘叶被制成风味爆珠[8]、复合袋泡茶[9]、固体饮料[10]等。
在食品原料加工过程中，粉碎是一步很重要的加工步骤，能够改善物料的物理特性和生理活性，广泛应用于食品、生物技术和医药等领域[11]。而目前在连翘叶资源利用方面的研究以及对其物理性质的研究还较少。本研究考察不同粉碎粒度对连翘叶的溶解性、持水力、膨胀力、持油力、堆积密度、振实密度等物理性质的影响，以及对多糖、黄酮、蛋白质溶出率的影响，评价其抗氧化活性，为连翘叶深加工提供新途径。
2. 材料与方法
2.1. 材料
晒干的连翘叶(陕西商洛地区)，芦丁、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G250、苯酚、ABTS、DPPH等购于合肥博美生物科技有限责任公司；无水乙醇、硫酸等有机试剂均为分析纯。
2.2. 仪器
拜杰多功能粉碎机BJ-300：浙江德清拜杰电器有限公司；电热鼓风干燥箱101：上海科恒实业发展有限公司；低速台式离心机TD5A：湖南凯达科学仪器有限公司；旋转蒸发器RE-52AA：上海亚荣生化仪器厂；电热恒温水浴锅HHS：上海博迅实业有限公司；可见分光光度计UV-721：上海佑科仪器仪表有限公司。
2.3. 实验方法
2.3.1. 样品制备
将连翘叶在3500 r/min的转速下粉碎5 min，得到连翘叶粗粉末，将粉末过不同目数的筛后得到平均粒度分别为60、150、250、450目的连翘叶粉末，备用。
2.3.2. 物理性质的测定
(1) 膨胀力测定[12]
分别称取不同粒度的连翘叶粉末各1 g，置于带刻度试管中，加入20 mL蒸馏水，充分振荡溶解，室温静置24 h，记录粉末占据的体积。根据下式计算连翘叶粉末的膨胀力：
(mL/g) = (V沉淀 − V样品)/m样品 (1)
(2) 水溶性测定[13]
称量1 g样品置于带刻度的试管中，向其中加蒸馏水25 mL，80℃条件下磁力搅拌30分钟，然后在转速为4500 r/min的条件下离心15 min。把上清液倒入培养皿中，干燥至其变得恒定，然后再称量。计算连翘叶粉末的水溶性的公式如下：
(g/g) = (W培养皿＋样品 − W培养皿)/W样品 (2)
(3) 持水力的测定[14]
在离心管中各称取1 g样品，将其和水按料液比1:25 (W/V)的比例互溶，磁力搅拌30 min，控制温度在25℃。然后将离心机转速调到4500 r/min，时间为15 min离心，最后留下沉淀物，称量离心管和沉淀物的重量，并进行记录。连翘叶粉末持水力计算公式如下：
(g/g) = (W样品＋空离心管 − W空离心管− W样品)/W样品 (3)
(4) 持油力的测定[15]
分别在管中称取1 g样品，按1:20的比例与花生油均匀混合，涡旋震荡30 s，于室温下静置1 h后在离心机转速为4500 r/min的条件下离心15 min，把沉淀留下。称量离心管以及连翘叶粉末的总质量。连翘叶粉末持油力的计算公式如下：
(g/g) = (W样品＋空离心管 − W空离心管− W样品)/W样品 (4)
(5) 堆积密度的测定[15]
分别在有刻度的管中称取1 g样品，观察并记录试管内连翘叶粉末所占的体积。计算连翘叶粉末堆积密度的公式如下：
g/mL = (m样品/V样品) (5)
(6) 振实密度的测定[15]
分别称取样品1 g，盛入带刻度的试管内上下振荡直至连翘叶粉末体积不再改变，此时记录连翘叶粉末在试管中所占体积。连翘叶粉末的振实密度计算公式如下：
(g/mL) = m样品/(V震荡前样品体积 − V震荡后样品体积) (6)
2.3.3. 溶出特性的测定
各称取1 g不同粒径的连翘叶粉末，加水100 mL与之混合搅拌均匀，在温度为70˚C条件下分别加热5 min、10 min、30 min、60 min、90 min，然后再进行抽滤，保存滤液，并对滤液中的黄酮类化合物、可溶性蛋白和可溶性多糖溶出量进行测定。
(1) 参考李仁杰等[16]的方法，采用分光光度法对黄酮的含量进行了测定。选择芦丁为标准品，取净25 mL容量瓶6只，按表1逐一添加试剂，摇匀后置于常温下10 min，510 nm处测定吸光值。以A值为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)，得回归方程为Y = 0.0553X + 0.005，R2 = 0.991。
Table 1. Rutin standard curve reaction system
表1. 芦丁标准曲线反应体系
项目 |
管1 |
管2 |
管3 |
管4 |
管5 |
管6 |
标准溶液(mL) |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
乙醇(mL) |
6 |
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
亚硝酸钠(mL) |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
硝酸铝(mL) |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
氢氧化钠(mL) |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
蒸馏水(mL) |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
7 |
取不同粒度的连翘叶粉末的滤液各5 mL，加1 mL乙醇溶液(60%)至6 mL，加浓度为5%的亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，5分钟后，加入1 mL的10%的硝酸铝溶液，搅拌均匀，10分钟后，加入10 mL 45% 的NaOH溶液，加7 mL蒸馏水到25 mL，摇匀后静置10 min，在510 nm下测定吸光值。
(2) 可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定[17]。精确称取0.1 g牛血清蛋白放入100 mL容量瓶中，加水配制标准蛋白溶液浓度为1000 μg/ mL。按表2内容在6个25 mL的试管中逐一加入试剂，将溶液摇晃混合均匀，静置5分钟后在595 nm处测定吸光值。以A值为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)，得回归方程为Y = 0.0041X + 0.0087，R2 = 0.9933。取不同粒度连翘叶粉末滤液各1 mL，加入5 mL考马斯亮蓝溶液，摇匀后静置5 min，在595 nm下测定吸光值。
Table 2. Bovine serum albumin standard curve reaction system
表2. 牛血清蛋白标准曲线反应体系
项目 |
管1 |
管2 |
管3 |
管4 |
管5 |
管6 |
标准溶液(mL) |
0 |
0.02 |
0.04 |
0.06 |
0.08 |
0.10 |
蒸馏水(mL) |
1 |
0.98 |
0.96 |
0.94 |
0.92 |
0.90 |
考马斯亮蓝(mL) |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
蛋白浓度(μg/mL) |
0 |
20 |
40 |
60 |
80 |
100 |
(3) 利用苯酚–硫酸法测定可溶性多糖含量[18]。取5 mg的葡萄糖标准品放到25 mL的容量瓶中，再加蒸馏水进行溶解，配成浓度为0.1 mg/mL的标准葡萄糖溶液。准备7个25 mL试管，根据表3逐步加入溶液。混匀后在40℃水浴锅中反应30 min，降温10 min，在波长490 nm处测定吸光值。以A值为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)，得回归方程为Y = 92.464X + 0.0139，R2 = 0.9976。
2.3.4. 抗氧化活性的测定
用70%的乙醇配置浓度为5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mg/mL的不同粒径连翘叶粉末溶液于30℃下超声提取30 min，然后在3500 r/min的转速离心15 min。取上清液备用。
Table 3. Glucose standard curve reaction system
表3. 葡萄糖标准曲线反应体系
项目 |
管1 |
管2 |
管3 |
管4 |
管5 |
管6 |
标准溶液(mL) |
0 |
0.2 |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
1.0 |
蒸馏水(mL) |
1 |
0.8 |
0.6 |
0.4 |
0.2 |
0 |
苯酚试剂(mL) |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
浓硫酸(mL) |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
葡萄糖浓度(mg/mL) |
0 |
0.001 |
0.002 |
0.003 |
0.004 |
0.005 |
(1) ABTS自由基清除率的测定[19]
配置ABTS溶液浓度为7 mmol/L，加入过硫酸钾溶液2.45 mmol/L等量搅拌，25℃下避光保存16~18小时备用。使用前用无水乙醇稀释至吸光值为0.7 ± 0.02。取不同浓度样品浸提液0.15 mL，分别放入试管内，加入稀释后的ABTS溶液2.85 mL，在25℃下反应10 min，734 nm波长处测定吸光值。对照组以0.15 mL乙醇溶液作为样品。ABTS自由基清除率的计算公式如下：
ABTS自由基清除率(%) = (1 − A1/A2) × 100% (7)
其中：A1为样品组的吸光度值；A2为对照组的吸光度值。
(2) DPPH自由基清除率的测定[20]
精确称取DPPH固体0.004 g于烧杯中，用无水乙醇溶解后定容至100 mL，在棕色瓶中避光保存。同时配制不同浓度的连翘叶样品，测定方法见表4。
Table 4. DPPH radical scavenging rate sample addition table
表4. DPPH自由基清除率加样表
组别 |
试剂 |
检测组 |
不同浓度的连翘叶溶液/Vc 20 μL + DPPH溶液180 μL |
对照组 |
20 μL的无水乙醇 + DPPH溶液180 μL |
空白组 |
无水乙醇200 μL |
在遮光条件下反应30 min，于540 nm波长处在酶标仪中测定OD值，DPPH自由基清除率计算公式如下：
(8)
其中：OD样品为连翘叶或者Vc吸光度值；OD空白为空白对照孔吸光度值；OD对照为对照孔吸光度值。
(3) 羟基自由基清除率的测定[21]
分别用60%乙醇溶液将连翘叶溶液稀释成不同浓度，静置备用。在96孔板中依次加入10 mmol/L的水杨酸60 μL、2.5 mmol/L盐酸60 μL、3.6 mmol/L硫酸亚铁60 μL、供试品溶液60 μL和0.88 mmol/L H2O2 60 μL。将孔板均匀振荡10 s，使各溶液混匀，在37℃条件下反应20 min，于490 nm波长处测定样品吸光度Ax，同法测定以60 μL乙醇(70%)代替供试品溶液后的空白吸光度A0和以60 μL蒸馏水代替H2O2后的样品吸光度AX0，精确测定后计算，公式如下：
(9)
(4) 还原力的测定[22]，见表5。
Table 5. Reducing power assay sample addition table
表5. 还原力的测定加样表
项目 |
管1 |
管2 |
管3 |
管4 |
管5 |
样品溶液(mL) |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1%铁氰化钾(mL) |
0.125 |
0.125 |
0.125 |
0.125 |
0.125 |
10%三氯乙酸(mL) |
0.125 |
0.125 |
0.125 |
0.125 |
0.125 |
氯化铁(mL) |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
添加铁氰化钾后，于50℃热水条件下反应20 min，然后依次添加三氯乙酸和氯化铁溶液并振荡搅拌均匀。于700 nm波长处测定吸光值。
3. 结果与分析
3.1. 物理性质的测定
3.1.1. 膨胀力的测定
如图1所示，随着连翘叶粉末粒径的减小，其膨胀力在不断的增大，450目粒径下的连翘叶粉末的膨胀力较60目的增长了63.15%，较150目和250目粉末也分别增长了30.3%和10.1%。
Figure 1. Measurement results of swelling power of Forsythia leaf powder with different particle sizes
图1. 不同粒度连翘叶粉末膨胀力的测定结果
3.1.2. 水溶性的测定
如图2所示，450目连翘叶粉末的水溶性与60目粉末相对比，水溶性增强了17.5%，而在150目和250目时差异并不明显。
3.1.3. 持水力的测定
如图3所示，随着粒径的减小连翘叶粉末的持水力在不断增大，在60目时持水力最小为2.368 mg/mL，在450目时其持水力达到了4.031 mg/mL，较60目增长了70%。
3.1.4. 持油力的测定
如图4所示，连翘叶粉末的持油力随着粒径的减小在不断增大，在450目时其持油力最高达到了3.319 mL/g，较60目时增加了61.6%。
Figure 2. Measurement results of water solubility of Forsythia leaf powder with different particle sizes
图2. 不同粒度连翘叶粉末水溶性的测定结果
Figure 3. Measurement results of water-holding capacity of Forsythia leaf powder with different particle sizes
图3. 不同粒度连翘叶粉末持水力的测定结果
Figure 4. Measurement results of oil-holding capacity of Forsythia leaf powder with different particle sizes
图4. 不同粒度连翘叶粉末持油力的测定结果
3.1.5. 堆积密度的测定
如图5所示，连翘叶粉末在60目的堆积密度与在450目下的堆积密度相比较，减小了61.3%，随着连翘叶粉末粒度不断减小，其表面积、摩擦力和排斥力均增大，阻碍了粉末颗粒间的致密堆积，且粉末越细越易粘结在一起，最终导致堆积密度呈现出下降趋势。
Figure 5. Measurement results of bulk density of Forsythia leaf powder with different particle sizes
图5. 不同粒度连翘叶粉末堆积密度的测定结果
3.1.6. 振实密度的测定
如图6所示，在450目时连翘叶粉末的振实密度最大为4.03 g/mL，较60目下增加了89%，而150目和250目时的振实密度仅相差16%。
Figure 6. Measurement results of tap density of Forsythia leaf powder with different particle sizes
图6. 不同粒度连翘叶粉末振实密度的测定结果
3.2. 溶出特性的测定
3.2.1. 黄酮溶出量的测定
如图7所示，粉末粒径越小黄酮溶出量越大，随着时间的增加，四种目数的连翘叶粉末黄酮溶出量一直增大，最高达到25.65 mg/mL。
Figure 7. Measurement results of flavonoid dissolution content
图7. 黄酮溶出量的测定结果
3.2.2. 可溶性蛋白溶出量的测定
如图8所示，连翘叶粉末中的蛋白质溶出量随着粒径的减小在不断增加，随着时间的增加，四种目数的连翘叶粉末蛋白溶出量一直增大，最高达到445.3 mg/mL。
Figure 8. Measurement results of soluble protein dissolution content
图8. 可溶性蛋白质溶出量的测定结果
3.2.3. 可溶性多糖溶出量的测定
如图9所示，随着粒径的减小连翘叶粉末中的可溶性多糖溶出量在不断增加，随着时间的增加，四种目数的连翘叶粉末多糖溶出量一直增大，最终在450目时达到0.03 mg/mL。
Figure 9. Measurement results of soluble polysaccharide dissolution content
图9. 可溶性多糖溶出量的测定结果
3.3. 抗氧化活性的测定
3.3.1. ABTS自由基清除率的测定
由图10可知，随着连翘叶提取液浓度的增大和粉末粒径的减小，连翘叶粉末对ABTS自由基清除率在不断增大。其中450目连翘叶粉末在浓度为5 mg/mL时对ABTS自由基清除率达到最高，为67.6%。
Figure 10. Measurement results of ABTS radical scavenging rate
图10. ABTS自由基清除率的测定结果
3.3.2. DPPH自由基清除率的测定
由图11可知，随着粉末浓度和目数的增大，连翘叶粉末对DPPH自由基清除率也呈现出上升的趋势，其中450目连翘叶粉末在浓度为5 mg/mL时对DPPH自由基的清除率达81.3%。
Figure 11. Measurement results of DPPH radical scavenging rate
图11. DPPH自由基清除率的测定结果
3.3.3. 羟基自由基清除率的测定
由图12可知，连翘叶粉末对羟基自由基的清除率随着样品浓度的增加也增大，其中450目连翘叶粉末在浓度为5 mg/mL时对羟基自由基清除率达71.5%。
Figure 12. Measurement results of hydroxyl radical scavenging rate
图12. 羟基自由基清除率的测定结果
3.3.4. 总还原力的测定
由图13可知，样品的吸光值随着样品浓度的增加而不断变大，其中450目连翘叶粉末在浓度为5 mg/mL时的总还原力达1.72。
Figure 13. Measurement results of reducing power
图13. 总还原力的测定结果
4. 讨论与结论
本研究结果表明，450目粒径下的连翘叶粉末较60目相比，膨胀力增长了63.15%、水溶性增强了17.5%、持油力增加了61.6%、振实密度增加了89%、堆积密度减小了61.3%、持水力也增加了70%；随着时间的增加，四种粒度连翘叶粉末中的黄酮、蛋白质、多糖的溶出量逐渐增大，最高分别达到了25.65 mg/mL、445.3 mg/mL、0.03 mg/mL；在浓度为5 mg/mL、目数为450目时，连翘叶粉末对ABTS自由基的清除率为67.6%、对DPPH自由基的清除率为81.3%以及对羟自由基的清除率为71.5%，并且还原力达到1.72。
由此可见，连翘叶的粉末粒径越小，越有利于其理化性质及抗氧化活性。本研究为连翘叶的进一步开发利用提供理论依据。
基金项目
商洛学院院士专项科研项目(20YSZX03)；商洛市科技计划项目(2022-Z-0001)；商洛学院秦创原创新创业孵化能力提升项目(22KYZX09)；陕西省大学生创新创业训练计划项目(S202311396057)。
NOTES
*通讯作者。