摘要: 目的：探讨靶向高通量测序(tNGS)在疑似肺炎患者中的诊断价值。方法：回顾性分析335例疑似肺炎患者的病例资料，所有患者均采集下呼吸道标本(首选肺泡灌洗液)并进行了tNGS检测和传统病原学检测(CMTs)。以综合诊断为标准分析tNGS和CMTs在疑似肺炎患者中的诊断效能，比较两者所检出的致病病原体分布以及在不同类型病原体中的诊断效能。结果：335名患者中，34名患者(10.1%)被诊断为非感染性病因，301名(89.9%)被诊断为感染性肺炎，其中270名患者被诊断为微生物学确诊的肺炎。以综合诊断为标准，tNGS的总体诊断敏感性(81.1% vs. 38.9%, P < 0.05)、准确度(80.0% vs. 44.2%, P < 0.05)、阴性预测值(33.8% vs. 14.8%, P < 0.05)显著高于CMTs；CMTs的总体诊断特异度则优于tNGS (91.2% vs. 70.6%, P < 0.05)。以综合诊断为标准，tNGS共鉴定出细菌166株、真菌48株、病毒28株、非典型病原体34株、分枝杆菌47株；CMTs共鉴定出细菌46株、真菌33株、病毒8株、非典型病原体10株、分枝杆菌33株。tNGS对不同病原菌的诊断效果不同，tNGS诊断总体细菌、真菌、病毒、非典型病原体、分枝杆菌的敏感性、阴性预测值和准确度均高于CMTs，但在诊断曲霉菌、结核分枝杆菌方面，两种方法诊断效能无明显统计学差异。结论：tNGS在疑似肺炎患者诊断中具有更广泛的病原体鉴定和更高的灵敏度和准确度。tNGS可以与传统病原学检测互为补充，为临床诊治提供有效指导。
Abstract: Objective: To explore the diagnostic value of targeted next-generation sequencing (tNGS) in patients with suspected pneumonia. Method: A retrospective analysis was conducted on the medical records of 335 patients with suspected pneumonia. All patients underwent collection of lower respiratory tract specimens (preferably bronchoalveolar lavage fluid), followed by testing with targeted next-generation sequencing (tNGS) and conventional microbiological tests (CMTs). Using a comprehensive diagnostic standard, the diagnostic performance of tNGS and CMTs in patients with suspected pneumonia was evaluated. The distribution of pathogenic microorganisms detected by both methods and their diagnostic efficacy for different types of pathogens were compared. Result: Among the 335 patients, 34 (10.1%) were diagnosed with non-infectious causes, and 301 (89.9%) were diagnosed with infectious pneumonia, with 270 cases confirmed microbiologically. Based on the comprehensive diagnostic standard, tNGS exhibited significantly higher overall diagnostic sensitivity (81.1% vs. 38.9%, P < 0.05), accuracy (80.0% vs. 44.2%, P < 0.05), and negative predictive value (33.8% vs. 14.8%, P < 0.05) than CMTs. However, CMTs demonstrated superior overall diagnostic specificity compared to tNGS (91.2% vs. 70.6%, P < 0.05). According to the comprehensive diagnostic standard, tNGS identified a total of 166 bacterial strains, 48 fungal strains, 28 viral strains, 34 atypical pathogen strains, and 47 mycobacterial strains, while CMTs identified 46 bacterial strains, 33 fungal strains, 8 viral strains, 10 atypical pathogen strains, and 33 mycobacterial strains. The diagnostic performance of tNGS varied for different pathogens. Overall, tNGS showed higher sensitivity, negative predictive value, and accuracy in diagnosing bacteria, fungi, viruses, atypical pathogens, and mycobacteria compared to CMTs. However, there was no statistically significant difference in diagnostic performance between the two methods for
Aspergillus and
Mycobacterium
tuberculosis. Conclusion: tNGS demonstrates a broader range of pathogen identification and higher sensitivity and accuracy in the diagnosis of suspected pneumonia patients. tNGS can complement traditional microbiological testing and provide effective guidance for clinical diagnosis and treatment.
1. 引言
肺炎是一种影响肺泡和肺远端支气管树的常见急性呼吸道感染[1]，根据最新的全球疾病负担研究表明，肺炎等下呼吸道感染在低收入国家仍是儿童和老年人的主要死因[2]。因此，快速、准确诊断病原体，并给予针对性用药，对于缩短病程、减少并发症和降低死亡率至关重要。然而，传统微生物检测(conventional microbiological tests, CMTs)诊断方法，如涂片镜检、分离培养、免疫学检测、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)等存在耗时较长、阳性率较低、病原谱窄等缺陷[3]。因此，需要一种诊断效率更高的病原体检测和鉴定方法。近年来，二代测序技术(next-generation sequencing, NGS)迅速发展，其中宏基因组二代测序技术(metagenomics next generation sequencing, mNGS)已被广泛应用于临床[4]。但mNGS费用昂贵并且受人源基因影响较大[5]。mNGS的一种替代方法是靶向高通量测序(targeted next-generation sequencing, tNGS)。tNGS是一种基于超多重PCR扩增(或靶向捕获)与高通量测序两种技术结合的新一代测序技术[6]。tNGS不仅具有检测速度快、受人源基因影响小、病原体谱范围清晰等优势，而且tNGS与mNGS在病原微生物检测中的诊断效能相当，并且测序成本更低[7]，因此tNGS在临床中越来越受到关注。本研究通过对同期进行tNGS和CMTs的患者进行回顾性分析，探讨tNGS在疑似肺炎患者中的诊断价值。此外，我们同时旨在探讨tNGS在细菌、真菌、病毒、非典型病原体、分枝杆菌等不同类型病原体中的诊断效能。
2. 资料与方法
2.1. 研究对象
回顾性选取2023年3月1日至2024年10月1日烟台毓璜顶医院呼吸与危重症医学科收治的疑似肺炎患者为研究对象。
纳入标准：1) 患者因疑似肺炎入院；2) 入院后采集下呼吸道标本(首选肺泡灌洗液)并进行了传统病原学检测和tNGS检测。3) 患者临床资料完整。排除标准：1) 拒绝tNGS检测的患者；2) 下呼吸道标本或检测过程未通过tNGS质量控制的患者；3) 临床和实验室资料不完整的患者。
疑似肺炎患者符合以下两个标准：1) 患者出现典型的肺炎临床表现，如发热、咳嗽、咳痰、呼吸困难等；2) 新发异常胸部影像表现。本研究为回顾性研究，已经医院伦理委员会批准。
2.2. 数据采集
从患者的电子病历系统中提取一般信息(姓名、性别、年龄、基础疾病、既往用药史)、主要症状(咳嗽、咳痰、呼吸困难、发热等)、诊断信息(入院诊断、出院诊断)、住院期间tNGS及传统微生物检测的结果、影像学检查及炎症指标(白细胞计数、中性粒细胞计数、血沉、C-反应蛋白、降钙素原)。
2.3. CMTs及结果分析
所有疑似患者在入院后72小时内采集下呼吸道标本，首选肺泡灌洗液标本，如患者无法耐受气管镜检查，可考虑留取合格痰液标本及诱导痰，并与其他相关样本(如咽拭子、血液和尿液)，根据临床诊治需要进行不同的传统病原学检测方法，包括：细菌、真菌、分枝杆菌涂片及培养检测；分枝杆菌、隐球菌和耶氏肺孢子菌的特殊染色；真菌的半乳甘露聚糖抗原(GM试验)和(1/3)-b-D-葡聚糖(G试验)以及荚膜隐球菌多糖抗原；结核/非结核分枝杆菌DNA检测(TB/NTM DNA)、结核及利福平耐药快速分子检测(Xpert MTB/RIF)、结核感染T细胞检测(T-SPOT)；呼吸道病原体9项IgM (肺炎支原体IgM、嗜军团菌IgM、Q热立克次体IgM、肺炎衣原体IgM、腺病毒IgM、呼吸道合胞病毒IgM、流感病毒A型IgM、流感病毒B型IgM、副流感病毒1/2/3型IgM)；各类病原体核酸(肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌复合群、肺炎衣原体、肺炎支原体、嗜肺军团菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、博卡病毒、鼻病毒、偏肺病毒、新型冠状病毒、呼吸道合胞病毒)以及提交尿液用于检测嗜肺军团菌和肺炎链球菌抗原。
同时采用下述标准进行CMTs结果的判读：细菌(不含分枝杆菌)：送检标本涂片镜检或培养阳性，口腔共生菌被视为污染物，除非主治医师认为其重要。真菌：送检标本的涂片镜检或培养阳性，并需考虑宿主因素、临床特征和治疗反应以确认临床诊断。病毒：PCR检测到目标病毒并排除呼吸道定植病毒。非典型病原体：送检标本PCR阳性或血清学检测阳性、尿标本军团菌抗原试验呈阳性并结合临床表现加以判断。分枝杆菌：抗酸染色阳性，并根据T-spot、Xpert或TB/NTM DNA测定等结果鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。
2.4. tNGS及结果分析
将送检CMTs中的下呼吸道标本的平行样本，同期送至金域医学检验中心进行tNGS检测，利用多靶点扩增和高通量测序技术，对样本中的微生物核酸序列进行分析，并与NCBI数据库中现有的微生物核酸序列进行比较，以进行微生物鉴定。检测过程包括核酸提取、文库构建、测序、生信分析和出具报告。由于tNGS报告结果的解读目前尚无统一标准，本研究tNGS结果解读参照既往研究[8] [9]和中国tNGS临床应用专家共识[10]，结合不同病原体的序列数、患者临床特征、传统检验结果以及治疗效果，确定潜在致病病原体标准为：1) 传统病原学检测结果与tNGS检测阳性病原体的结果一致；2) tNGS检测出阳性病原体，与患者的临床特征或治疗效果相符；3) tNGS与传统病原检测方法检出病原体不一致时，需要有文献证据表明其肺部致病性。
2.5. 综合分析
在本研究中，仅根据tNGS和CMTs的结果不足以判断检出病原体是否为致病、定植或被污染的。最终确定致病菌是基于临床综合诊断标准(即金标准)。即通过两名肺炎诊疗方面经验丰富的临床医生独立审查了患者的诊疗记录以及tNGS和CMTs的结果。首先，判断患者是否具有感染性或非感染性病因；然后根据临床表现、实验室检查、胸部影像学、微生物学检查和治疗效果来确定致病病原体。当两位医师意见不一致时，他们会进行进一步深入讨论。如果仍无法达成共识，则会咨询另一位资深医师。
2.6. 统计学方法
采用SPSS 28.0统计学软件分析数据。计量资料采用均数 ± 标准差(x ± s)表示，计数资料以n (%)表示。以临床综合诊断作为参考标准，计算tNGS和CMTs的诊断效能(包括灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度)。使用卡方检验、McNemar检验或Fisher精确检验来比较tNGS和CMTs的诊断效能。P < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. 一般资料
本研究最终纳入335名患者，其中男性182例(55.1%)，女性153例(44.9%)，平均年龄60.8 ± 15.1岁，平均住院时长9.8 ± 2.3天。主要临床症状为发热、咳嗽、咳痰、呼吸困难、胸痛、咯血。最常见的基础疾病是心血管疾病，其次是糖尿病。详细数据如表1所示。
Table 1. General clinical features of patients (n = 335)
表1. 患者的一般临床特征(n = 335)
项目 |
结果 |
性别 |
男(例/%) |
182 (54.3) |
女(例/%) |
153 (45.7) |
年龄(岁) |
|
60.8 ± 15.1 |
平均住院时间(天) |
|
9.8 ± 2.3 |
临床症状 |
发热(例/%) |
184 (54.9) |
|
咳嗽(例/%) |
231 (69.0) |
咳痰(例/%) |
178 (53.1) |
呼吸困难(例/%) |
168 (45.7) |
胸痛(例/%) |
23 (50.1) |
咯血(例/%) |
21 (6.3) |
实验室检查结果 |
白细胞计数(×109/L) |
8.59 ± 4.28 |
中性粒细胞计数(×109/L) |
6.95 ± 6.22 |
淋巴细胞计数(×109/L) |
1.82 ± 3.48 |
降钙素原(ng/ml) |
2.18 ± 9.89 |
C反应蛋白(mg/L) |
61.87 ± 85.56 |
血沉(mm/h) |
27.64 ± 20.98 |
基础疾病 |
心血管疾病(例/%) |
107 (31.9) |
慢性阻塞性肺疾病(例/%) |
35 (10.4) |
支气管哮喘(例/%) |
13 (3.8) |
糖尿病(例/%) |
53 (15.8) |
慢性肝脏疾病(例/%) |
23 (6.8) |
慢性肾脏疾病(例/%) |
20 (6.0) |
脑血管疾病(例/%) |
19 (5.7) |
恶性肿瘤(例/%) |
18 (5.4) |
3.2. CMTs和tNGS在疑似肺炎患者中的诊断效能
注：检出组：在感染患者中，CMTs或tNGS检出与综合诊断相符的致病病原体。误检组：在感染患者中，CMTs或tNGS检出与综合诊断不符的致病病原体。假阴性：在感染患者中，CMTs或tNGS未检出致病病原体。假阳性：在非感染患者中，CMTs或tNGS检测出致病病原体。真阴性：在非感染患者中，CMTs或tNGS未检出致病病原体。
Figure 1. Distribution of suspected pneumonia patients undergoing CMTs and tNGS testing
图1. CMTs和tNGS检测疑似肺炎患者的分布
根据对tNGS和CMTs结果等病历内容回顾性分析，以综合诊断为标准，在335名患者中，34名患者(10.1%)被诊断为非感染性病因，301名(89.9%)被诊断为感染性肺炎，其中270名患者被诊断为微生物学确诊的肺炎，31例患者虽未检测出具体致病菌，但根据其临床表现及诊疗过程，仍被诊断为感染性肺炎。如图1所示，在检测出301例感染性肺炎患者中，244例通过tNGS得到了准确的病原体结果；而117例感染患者则通过CMTs检测到准确的致病病原体。在34名非感染性肺炎患者中，有31名tNGS结果为阴性，24名CMTs结果为阴性。相应地，如表2所示，tNGS的敏感性(81.1% vs. 38.9%, P < 0.05)和准确度(80.0% vs. 44.2%, P < 0.05)显著高于CMTs；而特异度方面，CMTs优于tNGS (91.2% vs. 70.6%, P < 0.05)。
Table 2. Diagnostic performance of CMTs and tNGS in suspected pneumonia
表2. CMTs和tNGS对疑似肺炎的诊断性能
方法 |
敏感性% |
特异性% |
阳性预测值% |
阴性预测值% |
准确度% |
CMTs |
38.9* |
91.2* |
93.6 |
14.8* |
44.2* |
tNGS |
81.1 |
70.6 |
92.4 |
33.8 |
80.0 |
注：*：CMTs与tNGS检测的参数差异有统计学意义(P < 0.05)。
此外，如图1所示，在264例tNGS阳性患者中，244例与综合诊断结果相符；在71例tNGS阴性患者中，24名患者为非感染患者。如表2所示，对应阳性预测值(positive predictive value, PPV)为92.1%，阴性预测值(negative predictive value, NPV)为33.8%。相应地，CMTs的PPV为93.6%，NPV为14.8%。
3.3. CMTs和tNGS检出的致病病原体分布
注：tNGS+ CMTs−：仅tNGS阳性；CMTs+ tNGS−：仅CMTs阳性；tNGS+ CMTs+：tNGS和CMTs均阳性。
Figure 2. Distribution of pathogenic pathogens identified by CMTs and tNGS
图2. CMTs和tNGS鉴定的致病病原体分布
我们依据综合诊断判定主要致病菌的分布如图2所示。tNGS与CMTs在335例患者中共鉴定出了27种致病病原体，共349株，其中细菌(不含结核分枝杆菌) 169株，真菌60株、病毒29株、非典型病原体36株、分枝杆菌55株。
通过tNGS共鉴定出14种致病细菌，共166株，最常见的是肺炎克雷伯菌(39株)，其次是铜绿假单胞菌(37株)、鲍曼不动杆菌(19株)、金黄色葡萄球菌(20株)、流感嗜血杆菌(20株)；而使用CMTs仅鉴定出10种致病细菌，共46株，最常见的有铜绿假单胞菌(16株)、鲍曼不动杆菌(9株)、肺炎克雷伯菌(8株)、金黄色葡萄球菌(6株)。在真菌方面，tNGS所鉴定出最多的致病真菌是曲霉菌(27株)，其它包括有耶氏肺孢子菌(14株)、白色念珠菌(6株)、隐球菌(1株)；CMTs鉴定出的真菌有曲霉菌(24株)、白色念珠菌(5株)、耶氏肺孢子菌(2株)、隐球菌(2株)。tNGS鉴定出的主要致病病毒有甲型流感病毒(16株)、新型冠状病毒(7株)、巨细胞病毒(3株)、腺病毒(2株)；CMTs鉴定出的主要致病病毒是甲型流感病毒(3株)、新型冠状病毒(3株)、巨细胞病毒(1株)、腺病毒(1株)。非典型病原体方面，tNGS鉴定最多的是支原体(32株)，此外还包括嗜肺军团菌(1株)、鹦鹉热衣原体(1株)；CMTs只鉴定出支原体(10株)。tNGS与CMTs主要检测到2种分枝杆菌属，tNGS检测到结核分枝杆菌(33株)和非结核分枝杆菌(14株)；CMTs同样检测到结核分枝杆菌(26株)与结核分枝杆菌(7株)。
3.4. tNGS和CMTs在不同类型病原体中的诊断效能
以综合诊断为金标准，计算tNGS和CMTs在不同类型病原体中的诊断效能，我们发现，在不同类型的病原体之间，tNGS和CMTs的诊断效能存在差异。如表3所示，在细菌检测中(不含结核分枝杆菌)，tNGS诊断灵敏性(98.4% vs. 32.8%, P < 0.05)、NPV (98.9% vs. 70.5%, P < 0.05)和准确度(92.5% vs. 74.0%, P < 0.05)均高于CMTs；而CMTs在诊断特异性(99.5% vs. 89.0%, P < 0.05)和PPV (97.7% vs. 84.6%, P < 0.05)方面优于tNGS。在本研究中，tNGS对大部分常见细菌诊断的敏感性、NPV及准确度均显著高于CMTs，如：克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌。
tNGS对真菌检测的敏感性(79.7% vs. 54.3%, P < 0.05)和NPV (95.6% vs. 91.1%, P < 0.05)高于CMTs；而CMTs的诊断特异性(99.6% vs. 95.3%, P < 0.05)和PPV (97.0% vs. 78.3%, P < 0.05)高于tNGS；两者在诊断准确度方面无明显差异。在耶氏肺孢子菌的检测中，tNGS诊断的灵敏性(100% vs. 14.3%, P < 0.05)和NPV (100% vs. 96.4%, P < 0.05)高于CMTs；而在诊断特异性、PPV和准确度方面两者相当，无统计学差异。对曲霉属而言，tNGS在诊断敏感性、NPV和准确度方面略高于CMTs，但无显著统计学差异。
对于病毒的检测，tNGS的敏感性(96.4% vs. 25.0%, P < 0.05)显著高于CMTs，在NPV (100% vs. 93.6%, P < 0.05)和准确度(99.1% vs. 93.4%, P < 0.05)方面也高于CMTs。而两者在特异性和PPV方面无显著差异。tNGS在甲流的诊断效能与总体病毒一致，即敏感性(94.1% vs. 17.6%, P < 0.05)、NPV (99.7% vs. 95.8%, P < 0.05)和准确度(99.4% vs. 95.8%, P < 0.05)方面均优于CMTs。而在新冠诊断中，tNGS显示出较CMTs更高的敏感性、准确度、NPV，但差异未达到统计学显著性。
tNGS在诊断非典型病原体方面与病毒类似，tNGS的敏感性(94.4% vs. 27.8%, P < 0.05)、NPV (99.3% vs. 91.8%, P < 0.05)和准确度(97.6% vs. 90.4%, P < 0.05)均高于CMTs，而特异性、PPV方面无显著差异。tNGS与CMTs在支原体方面诊断效能的差异与总体非典型病原体一致，即敏感性(94.1% vs. 29.4%, P < 0.05)、NPV (99.3% vs. 92.5%, P < 0.05)和准确度(97.9% vs. 91.0%, P < 0.05)均高于CMTs，而特异性和PPV方面无显著差异。
tNGS对分枝杆菌检测的诊断准确性高于CMTs (95.8% vs. 91.9%, P < 0.05)，这主要是因为tNGS对非结核分枝杆菌的敏感性较高(87.5% vs. 43.8%, P < 0.05)。而在结核分枝杆菌的诊断效能方面，两者无明显差异。
Table 3. Comparison of diagnostic performance of CMTs and tNGS in different types of pathogens
表3. CMTs和tNGS在不同类型病原体中的诊断性能的比较
|
CMTs |
tNGS |
敏感性% |
特异性% |
PPV % |
NPV % |
准确度% |
敏感性% |
特异性% |
PPV % |
NPV % |
准确度% |
细菌 |
32.8* |
99.5* |
97.7* |
70.5* |
74.0* |
98.4 |
89.0 |
84.6 |
98.9 |
92.5 |
肺炎克雷伯菌 |
20.0* |
99.7* |
89.0 |
90.2* |
90.1* |
97.5 |
95.9 |
76.5 |
99.6 |
96.1 |
铜绿假单胞菌 |
42.1* |
100 |
100 |
93.1* |
93.4* |
97.3 |
99.0 |
92.5 |
99.7 |
98.8 |
鲍曼不动杆菌 |
45.0* |
100 |
100 |
96.6* |
96.7 |
95.0 |
99.4 |
90.5 |
99.7 |
99.1 |
金黄色葡萄球菌 |
30.0* |
100 |
100 |
95.7* |
95.8* |
100 |
99.0 |
87.0 |
100 |
99.1 |
流感嗜血杆菌 |
5.0* |
100 |
100 |
94.3* |
94.3* |
100 |
98.7 |
83.3 |
100 |
98.8 |
真菌 |
54.3* |
99.6* |
97.0* |
91.1* |
91.6 |
79.7 |
95.3 |
78.3 |
95.6 |
92.5 |
曲霉菌 |
64.9 |
100 |
100 |
95.8 |
96.1 |
73.0 |
100 |
100 |
96.8 |
97.0 |
耶氏肺孢子菌 |
14.3* |
99.7 |
66.7 |
96.4* |
96.1 |
100 |
98.1 |
70.0 |
100 |
98.2 |
病毒 |
25.0* |
99.7 |
87.5 |
93.6* |
93.4* |
96.4 |
99.3 |
90.0 |
100 |
99.1 |
甲型流感病毒 |
17.6* |
100 |
100 |
95.8* |
95.8* |
94.1 |
99.7 |
94.1 |
99.7 |
99.4 |
新型冠状病毒 |
42.9 |
100 |
100 |
98.8 |
98.8 |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
非典型病原体 |
27.8* |
98.0 |
62.5 |
91.8* |
90.4* |
94.4 |
98.0 |
85.0 |
99.3 |
97.6 |
支原体 |
29.4* |
98.0 |
62.5 |
92.5* |
91.0* |
94.1 |
98.3 |
86.5 |
99.3 |
97.9 |
分枝杆菌 |
56.9* |
99.3 |
94.3 |
91.7* |
91.9* |
81.0 |
98.9 |
94.0 |
96.1 |
95.8 |
结核分枝杆菌 |
61.9 |
100 |
100 |
94.8 |
95.2 |
78.6 |
99.7 |
97.1 |
97.0 |
97.0 |
非结核分枝杆菌 |
43.8* |
99.4 |
77.8 |
99.2* |
96.7 |
87.5 |
99.4 |
87.5 |
99.3 |
98.8 |
注：*：CMTs与tNGS检测的参数差异有统计学意义(P < 0.05)。
4. 讨论
本文对335例疑似肺炎患者进行了回顾性分析，其中301名患者根据综合诊断最终诊断为肺部感染性疾病，其中大部分患者存在感染性病原体，最常见的病原体是铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌和结核分枝杆菌。此外，我们发现在不同类型的病原体之间，tNGS和CMTs的诊断效能存在差异。
研究发现，tNGS检出的病原体种类与CMTs相近，但检出数量显著高于CMTs，这说明tNGS可以较好地覆盖临床常见肺炎致病病原体。与此类似，先前的研究表明tNGS的病原体谱可以覆盖临床95%以上的病例[11]。并且tNGS在感染性肺炎病原体检测中的敏感性、NPV和准确度均高于CMTs。在Guo等的一项前瞻性研究中也同样发现tNGS具有高敏感性的特点[9]。因此，tNGS可以作为肺炎传统检测的重要辅助工具，从而提高复杂感染性肺炎病原体检测的灵敏度，并为疾病管理提供新的视角。
我们研究的优势是评估了tNGS在不同类型病原体方面的诊断效能，本次检出的致病细菌中革兰氏阴性菌在致病菌中数量居多，这与先前研究一致[9]。革兰氏阴性菌中较常见的致病菌有肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌；而在革兰氏阳性菌中金黄色葡萄球菌较为常见。我们发现tNGS对各种致病细菌的识别比CMTs有更好的敏感性和NPV。同样，在一项纳入48名重症肺炎患者的回顾性研究中[12]，高通量靶向扩增子测序在检测细菌方面也展现出高敏感性。可见tNGS能够帮助医生更准确地排除某些细菌性肺炎的可能性，从而减少误诊和过度检查。
我们的研究结果表明，tNGS在总体真菌检测方面具有出色的敏感性，而CMTs的特异性则优于tNGS，且两者在识别特定真菌菌株方面略有差异。在本研究中，tNGS不仅在检测耶氏肺孢子菌菌株数量上显著高于CMTs，并且敏感性方面也具有显著的优势。然而，曲霉菌检测方面，tNGS检出曲霉菌数量多于CMTs，并且我们观察到tNGS的诊断敏感性、准确度略高于CMTs，但无明显统计学差异。在既往研究中，与tNGS同样基于高通量测序的mNGS在真菌检测方面的敏感性、准确度显著低于CMTs [4]。这可能是由于tNGS通过设计针对曲霉菌特定基因序列的引物或探针，能够实现对目标曲霉菌的靶向富集和高通量测序，使得即使在曲霉菌载量较低的情况下也能准确检测出，从而提高曲霉菌检测的敏感性及准确度。此外，本研究中大部分白色念珠菌经综合诊断判定为定植者或污染物而非致病菌，因为念珠菌是常见的条件致病菌，存在于口腔和上呼吸道中[13]，在采集下呼吸道标本中易受干扰，因此可能导致假阳性结果。因此，对念珠菌肺炎的诊断需要结合宿主因素、临床特征和微生物学证据等因素综合诊断。
在病毒检测方面，传统的病毒检测方法主要包括血清学检测和核酸检测等，可检测病原体的种类非常有限，容易遗漏临床不常见的病毒[14]。本研究中tNGS检出较多种类病毒，但大部分检出的病毒致病力较弱，且未给予治疗患者病情好转，因此考虑定植可能性大，所以并未列举在致病病毒内。此外，tNGS诊断病毒感染的敏感性、准确性和NPV均优于CMTs，尤其是在甲流的诊断中表现更为突出。而对于新型冠状病毒，我们考虑由于样本量较小且多数单纯新型冠状病毒核酸阳性患者并不继续进行tNGS检验，因此两种方法之间没有明显统计学差异。此外，tNGS相对于mNGS可以同时进行DNA和RNA双过程检测，可在短时间内检测出多种病毒[6]，可以为临床医生提供更全面的病毒诊断。
非典型病原体检测的传统方法如涂片镜检、培养和血清学检测存在培养条件苛刻、低敏感性等缺点[15]。本研究中tNGS对非典型病原体的敏感性显著高于CMTs，特别是在支原体检测方面。此外，本研究中tNGS检出了鹦鹉热衣原体、嗜肺军团菌等少见病原体，而这些病原体在传统方法中未能检出。在之前的研究中，Yan等通过对6例鹦鹉热衣原体肺炎病例的回顾性分析发现，发现tNGS作为一种新型诊断技术，能够快速、准确且经济高效地检测鹦鹉热衣原体肺炎[16]。并且在一位淋巴结病的女士的嗜肺军团菌感染个案报道中[17]，tNGS帮助识别嗜肺军团菌感染并开始早期治疗。综上可见，这表明tNGS对非典型病原体检测具有较高的优势。
在本研究中，tNGS与CMTs在结核分枝杆菌的诊断方面没有明显差异。这与既往研究的结果不一致[5]，这可能是因为本研究的传统方法中纳入了敏感性较高的Xpert MTB/RIF [18]，既往研究也证实了tNGS对结核分枝杆菌的诊断效能与Xpert MTB/RIF相似[19]。因此，在临床上考虑是否存在结核分枝杆菌感染时，可以优先考虑以Xpert MTB/RIF为代表的传统方法。而在非结核分枝杆菌的诊断方面，本研究显示tNGS具有出色的灵敏性。目前全球范围内发现的非结核分枝杆菌越来越多[20]，由于并非所有抗酸染色阳性的患者都患有结核分枝杆菌感染，而临床传统的微生物培养法和影像学难以对其进行区分。因此，tNGS由于其卓越的灵敏度，可能成为识别分枝杆菌的有效方法。综上可见，tNGS在鉴定分枝杆菌菌种和区分“涂片抗酸染色阳性”病原体方面具有较高的参考价值。
使用tNGS进行病原体检测方面的优势已在神经系统感染[21]、假体周围关节感染[22]、败血症[23]等疾病中得到证实。然而，tNGS在临床中的应用仍然存在局限性，目前解释tNGS结果非常困难，主要因为难以区分定植和感染，特别是机会性感染，这一判断更加困难。考虑到个体化的临床情况，用固定的标准来判断病例是否为特定微生物感染是不切实际的，特别是在多种病原体混合感染的情况下。此外，tNGS无法检测致病菌的活性。并且有研究表明，即使tNGS耐药基因检测结果为阳性，也不能确认微生物对相应药物具有耐药性[8]。因此，在使用tNGS检测耐药基因时，应结合传统的微生物培养进行药敏分析，并且优先考虑药敏试验结果，这还需进一步研究完善。
本研究同样存在以下不足之处：首先，最终诊断是由两到三位临床专家根据患者的综合情况确定，但不可避免地存在主观偏差。其次，本研究中样品采集方法和地点缺乏标准化也可能影响到tNGS的结果，样品采集方法和样品类型对tNGS效能的影响还有待进一步评价。第三，本研究入组的大多数患者在入院前接受过抗感染治疗，这可能导致传统方法敏感性的低估以及机会性病原体引起感染的机会较高。第四，该研究主要针对疑似肺炎患者，因此很难将结论推广到所有感染性疾病。因此，需要对tNGS在不同类型感染性疾病中的应用进行更多研究。
综上所述，tNGS在疑似肺炎患者中具有较高的诊断价值。与传统病原学检测相比，tNGS不仅能够检出更多的病原体，还能有效覆盖临床常见肺炎病原体。tNGS在疑似肺炎患者的诊断中表现出很高的灵敏性和准确度。tNGS在基层群体和常见感染患者中具有良好的应用前景，它可以和传统病原学检测互为补充，从而提供快速、准确的病因诊断，进而为精准临床治疗提供具有成本效益和高度可定制的解决方案。
NOTES
*通讯作者。