1. 引言

重度抑郁症(MDD)也称为严重抑郁障碍，是一种严重的情绪障碍，影响着全世界3500多万人[1]。而相关报告显示，超80%成年人自评心理健康状况良好，抑郁风险检出率约为1/10。青少年群体有14.8%存在不同程度的抑郁风险，高于成年群体，需要进行有效干预和及时调整[2]。青少年抑郁症的原因往往是多方面的，包括遗传因素、生物学因素、心理因素和环境因素。家庭环境的不稳定、学业压力、人际关系问题、身体疾病或慢性疼痛、药物滥用等都可能增加青少年抑郁症的风险。治疗青少年抑郁症的方法包括心理治疗和药物治疗。心理治疗可以帮助青少年了解和应对抑郁症状，提高心理应对能力，改变消极的思维方式。药物治疗主要使用抗抑郁药物，包括选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)等抗抑郁药物。然而，在青少年中使用抗抑郁药物需要谨慎，因为一些药物可能对其脑发育产生不良影响，或者出现副作用如情绪波动、自杀倾向等。因此，在药物治疗中需要进行全面的评估和监测。特别是，青少年抑郁症发病的神经病理生理过程与成年人相比存在一些差异，可能以更突出的激素和神经发育成分为特征[3]-[6]。

下丘脑–垂体–肾上腺(HPA)轴是激素应激反应的主要神经内分泌通路，HPA轴是一个负责应激反应调节的生物轴，它包括下丘脑中的释放促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)神经元、垂体中的促肾上腺皮质激素(ACTH)和肾上腺皮质中的皮质醇(一种应激激素) [7]。在重度抑郁症患者中，HPA轴的功能常常失调。研究表明，患有重度抑郁症的人体内CRH的分泌量增加，导致垂体分泌更多的ACTH，最终导致肾上腺皮质分泌更多的皮质醇。这种过度的皮质醇分泌可以对大脑产生负面影响，包括影响神经递质的平衡和神经元的功能。而微生物组–肠道–大脑(MGB)轴可能是应激效应传递到HPA轴的一个重要通道，MGB轴是指肠道微生物与大脑之间的相互作用系统[8]-[11]。MGB轴的组成包括肠道微生物群落、肠道黏膜屏障和神经系统。与青少年神经发育相关的研究表明，MGB轴在青少年神经发育中发挥重要作用。青少年期是大脑发育的关键时期，MGB轴的异常可以影响青少年的情绪调节、认知能力和学习记忆等方面[12]。研究发现，肠道微生物群落的失调与青少年精神障碍(如抑郁症和焦虑症)的发生和发展密切相关。此外，肠道微生物群落的调节可以通过改善肠道黏膜屏障的功能和调节神经递质的合成和释放，对青少年神经发育产生积极影响。因此，我们想要研究青少年抑郁症患者的肠道菌群是否具有特异性并尝试找出其中的标志物种。

2. 材料与方法

2.1. 样本

按照一定标准从公共数据库中挑选16S扩增子测序数据，从不同年龄段(儿童、青少年和老年人群体)收集了414个肠道样本(见表1)。并按照不同年龄段(group)以及健康状态(type)进行分组。

Table 1. Data information table

表1. 数据信息表

2.2. 方法

2.2.1. 数据处理

数据最初使用QIIME2 [13]管道进行处理，通过OUT (操作性分类单元)分析对样本中的微生物进行分类。使用tools插件导入样本，使用demux插件解复用，并使用dada2插件去噪，以获得扩增子序列变体(asv)。使用phylogeny插件生成系统发育树，使用featureclassifier插件和Silva [14] (release 132) 99% identity V4分类器分配分类，使用picrust2插件进行功能预测，导出特征表、代表性序列、根系统发育树和QIIME2的注释信息，并利用生物格式包的添加元数据功能，将特征表、分类法和样本元数据合并为统一的生物格式文件。后续导入R中进行后续的多样性分析以及线性判别分析效应。

2.2.2. 特征选取

使用t检验、Mann-Whitney U检验、ANOVA或Kruskal-Wallis检验，筛选出在不同组间显著差异的菌属。结合统计检验和线性判别分析，筛选出组间显著差异的菌属。结合微生物学领域的先验知识，解释所选菌属的生物学意义。

3. 结果

3.1. 微生物群多样性

首先对数据进行预处理后进行OTU聚类和注释，根据OTU的序列信息进行物种注释，能将分析结果与实际的生物学意义进行关联，从而研究群落中物种的变化关系等内容。展示相对丰度最高的35个菌属(图1)，拟杆菌属(Bacteroides)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)和阿克曼氏菌(Akkermansia)在不同组别中显示出显著聚类趋势。

Figure 1. Heat map of the top 35 species in relative abundance

图1. 相对丰度top 35物种热图

根据不同健康状态分析了Alpha多样性(图2)，研究中使用了以下Alpha多样性指标：Observed species：观察到的物种数量，反映物种丰富度。Shannon指数：综合考虑物种丰富度和均匀度，值越高表示多样性越高。PD_whole_tree：基于系统发育树的多样性指数，反映物种的进化多样性。Observed species (观察到的物种数量) MDD组vs CON组：p-value：0.77 (无显著差异)。结果：抑郁症患者(MDD组)和健康对照组(CON组)在观察到的物种数量上没有显著差异，表明两组的物种丰富度相似。Shannon指数MDD组vsCON组：p-value：0.74 (无显著差异)。结果：MDD组和CON组在Shannon指数上没有显著差异，表明两组的物种丰富度和均匀度相似。PD_whole_tree (系统发育多样性)MDD组vs CON组：p-value：2.43e-05 (显著差异)。结果：MDD组和CON组在系统发育多样性上存在显著差异，MDD组的系统发育多样性显著低于CON组，表明MDD组的物种进化多样性较低。

MDD组和CON组的肠道微生物多样性在物种丰富度和均匀度上没有显著差异，表明两组的多样性在物种数量和分布上相似。而MDD组的系统发育多样性显著高于CON组，表明MDD组的物种进化多样性更高，可能反映了抑郁症患者肠道菌群在进化上的独特特征。这种差异可能与抑郁症的病理生理机制相关，例如肠道菌群通过微生物群–肠道–脑轴影响神经内分泌和免疫系统。高物种进化多样性的肠道菌群可能是抑郁症的一个潜在标志，表明肠道微生物群的失衡可能与抑郁症的发生密切相关。

(a) (b)

(c) (d)

Figure 2. Alpha diversity index of different state groups. (a) good_coverage; (b) observed_species; (c) PD_whole_tree; (d) Shannon

图2. 不同状态组Alpha多样性指数图。(a) good_coverage；(b) observed_species；(c) PD_whole_tree；(d) Shannon

然后，我们利用Beta多样性指标结合PCoA分析来评估不同健康状态微生物组在整个社区水平上是否不同，通过PCoA分析(图3)发现MDD组和CON组的肠道微生物群体在空间上有明显的分离。MDD组的菌群呈现更紧密的分布，而CON组则呈现出更广泛的分布。这种差异可能表明抑郁症患者的肠道菌群处于一种相对“固定”的状态，而健康对照组的菌群则表现出更多的多样性。MDD组和CON组在菌群组成上存在显著差异，MDD组的菌群结构与健康对照组明显不同。在高丰度物种的相对丰度上也存在显著差异，提示抑郁症可能影响了肠道菌群中高丰度物种的分布。这种差异可能反映了抑郁症对肠道菌群的影响，提示肠道菌群可能作为抑郁症的潜在生物标志物。

(a) (b)

(c) (d)

Figure 3. Analysis of Beta diversity index PCoA in different state groups. (a) binary_jaccard; (b) bray_curtis; (c) unweighted_unifrac; (d) weighted_unifrac

图3. 不同状态组Beta多样性指数PCoA分析图。(a) binary_jaccard；(b) bray_curtis；(c) unweighted_unifrac；(d) weighted_unifrac

3.2. 分类组成

Figure 4. Bar chart of LDA analysis species between different state groups

图4. 不同状态组间LDA分析物种条形图

为了评估抑郁和健康组的菌群组成是否存在差异，我们利用线性判别分析效应大小(LDA)工具来识别每组生物标志物的分类群。通过线性判别分析(LDA)比较抑郁组(MDD)和对照组(CON)的微生物群体差异(图4)，发现MDD组中富集的菌属包括普雷沃菌属(Prevotella)、戴阿利斯特杆菌属(Dialister)等，而CON组中富集的菌属包括拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)等。MDD组中富集的菌属(如普雷沃菌属、戴阿利斯特杆菌属)与炎症和代谢紊乱相关，而CON组中富集的菌属(如双歧杆菌属、拟杆菌属)通常与肠道健康相关。青少年抑郁症患者的肠道菌群与健康对照组存在显著差异，MDD组中富集的菌属可能与抑郁症的发病机制相关。

3.3. 代谢通路

Figure 5. Metabolic pathway ALDEx2 Welch’s t-test

图5. 代谢通路ALDEx2 Welch’s t-test

代谢通路分析通过宏基因组测序数据揭示了抑郁症患者(MDD)和健康对照组(CON)在代谢功能上的差异(图5)。氨基酸代谢通路：MDD组的氨基酸代谢通路，尤其是与L-glutamate和L-glutamine合成相关的通路，活性较高。L-glutamate作为一种神经递质，与大脑功能密切相关，其代谢异常可能与抑郁症的发生相关。MDD组的氨基酸代谢通路的改变，可能表明抑郁症的发生与神经递质的平衡失调有关。脂肪酸代谢通路：MDD组在脂肪酸回收和合成相关的通路上显示出较高的活性，这可能与抑郁症患者的能量代谢异常有关。抑郁症患者可能面临能量供应问题，进而影响到肠道菌群的组成和功能。厌氧呼吸和代谢：在厌氧代谢通路中，MDD组的活性较高，这表明在抑郁症患者的肠道中，可能有较多的厌氧性微生物。这一现象可能与抑郁症患者的肠道屏障功能受损，肠道内的厌氧微生物的增殖相关，进一步影响到免疫反应和神经系统功能。特定酶活性变化：在MDD组中，D-psicose 3-epimerase和D-tagatose 3-epimerase等糖代谢相关酶的丰度较高，而guanine deaminase在MDD组中的丰度较低，提示抑郁症患者可能在核苷酸代谢上出现了障碍。另一方面，MDD组在氨基酸合成酶、脂肪酸合成酶和糖代谢酶的表达上普遍较高，可能与体内能量平衡的改变以及神经递质的调节相关。

MDD组中显著高表达的代谢通路包括葡萄糖苷酸降解、L-谷氨酸和L-谷氨酰胺合成、脂肪酸回收、厌氧呼吸等，提示MDD组在核苷酸代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢和厌氧代谢方面存在显著变化。CON组中显著高表达的代谢通路包括吡啶酸和硫酸还原、辛烯氧化、蔗糖降解等，提示健康对照组在核苷酸代谢、脂质代谢和糖类代谢方面更为活跃。通过DESeq2分析(图6)进一步揭示了MDD组在肽聚糖生物合成、dTDP-N-乙酰硫代甘露糖生物合成、脂肪酸回收等通路中的显著差异，提示MDD组中可能存在细菌细胞壁和细胞膜组分的代谢调整。这些肠道菌群和代谢途径的变化可能与抑郁症的多种病理生理过程相关。例如，氨基酸代谢、脂肪酸代谢和厌氧代谢通路的改变可能影响到大脑功能、免疫系统以及神经递质的合成与代谢，从而加剧抑郁症的症状。此外，肠道微生物群的失衡可能导致肠脑轴的功能改变，进一步影响情绪和认知功能的调节，提示肠道菌群可能在抑郁症的发生和发展中发挥重要作用。

Figure 6. DESeq2 analysis results

图6. DESeq2分析结果

在MDD组中，D-psicose 3-epimerase和D-tagatose 3-epimerase等糖代谢相关酶的丰度较高(图7)，而guanine deaminase在MDD组中的丰度较低，提示抑郁症患者可能在核苷酸代谢上出现了障碍。另一方面，MDD组在氨基酸合成酶、脂肪酸合成酶和糖代谢酶的表达上普遍较高，可能与体内能量平衡的改变以及神经递质的调节相关。并且MDD组在多个基因的丰度上表现出显著差异(图8)，尤其是与糖代谢、嘌呤代谢、厌氧代谢和脂质代谢相关的基因。这些变化可能进一步揭示了MDD组在代谢途径和微生物功能上的调节差异。

Figure 7. Comparison of EC enzyme abundance with ALDEx2 Welch’s t-test

图7. EC酶丰度比较ALDEx2 Welch’s t-test

Figure 8. Comparison of KO gene abundance with ALDEx2 Welch’s t-test

图8. KO基因丰度比较ALDEx2 Welch’s t-test

4. 讨论

本研究通过分析16S扩增子测序数据，系统分析了青少年抑郁症患者的肠道菌群特征，并鉴定了潜在的生物标志物。研究结果表明，青少年抑郁症患者的肠道菌群与健康对照组存在显著差异，尤其是在菌群多样性、分类组成和代谢功能方面。这些发现为理解肠道菌群在抑郁症发病机制中的作用提供了新的视角。

首先，我们发现青少年抑郁症患者的肠道菌群多样性显著降低，这与先前的研究结果一致。肠道菌群多样性的降低可能与抑郁症患者的免疫系统功能失调、炎症反应增强以及神经递质代谢异常有关。此外，MDD组的菌群结构呈现出更为紧密的分布，而健康对照组则表现出更高的多样性，提示抑郁症患者的肠道菌群可能处于一种相对“固定”的状态，这种状态可能与抑郁症的病理生理过程密切相关。

其次，通过线性判别分析(LDA)，我们鉴定出了一些在抑郁症患者中显著富集的菌属，如普雷沃菌属(Prevotella)、戴阿利斯特杆菌属(Dialister)和拟杆菌属(Bacteroides)。这些菌属与炎症反应、代谢紊乱和肠道屏障功能失调密切相关。特别是普雷沃菌属，已有研究表明其与炎症性肠病和代谢综合征相关，提示其在抑郁症中的富集可能与炎症反应的增强有关。此外，双歧杆菌属(Bifidobacterium)在健康对照组中显著富集，进一步支持了益生菌在维持肠道健康和情绪调节中的积极作用。这些菌属的鉴定为理解肠道菌群在抑郁症中的作用提供了新的线索，并可能成为未来抑郁症诊断和治疗的潜在靶点。

代谢通路分析揭示了抑郁症患者在氨基酸代谢、脂肪酸代谢和厌氧代谢方面的显著变化。特别是L-谷氨酸和L-谷氨酰胺代谢通路的异常，可能与抑郁症患者的神经递质平衡失调有关。L-谷氨酸作为一种重要的兴奋性神经递质，其代谢异常可能直接影响到大脑的功能，进而加剧抑郁症状。此外，脂肪酸代谢和厌氧代谢通路的改变可能反映了抑郁症患者的能量代谢异常，提示肠道菌群在能量供应和神经递质合成中的重要作用。

但本研究的样本量相对较小，且主要集中在青少年群体。抑郁症的发病机制复杂，可能受到年龄、性别、遗传背景、饮食习惯等多种因素的影响。因此，研究结果的普适性需要进一步验证。未来的研究应扩大样本量，并纳入不同年龄段和人群，以提高结果的可靠性和普适性。并且16S扩增子测序技术虽然能够提供菌群组成的信息，但其分辨率有限，无法提供菌株水平的功能信息。此外，该技术无法直接反映菌群的代谢活性。未来的研究可以结合宏基因组测序和代谢组学技术，更全面地揭示肠道菌群的功能及其与抑郁症的关系。本研究为横断面研究，无法确定肠道菌群的变化是抑郁症的原因还是结果。尽管有研究表明肠道菌群可能通过“肠–脑轴”影响中枢神经系统，但仍需通过纵向研究和干预实验(如粪菌移植或益生菌干预)来验证肠道菌群与抑郁症之间的因果关系。

近年来，越来越多的研究表明，肠道菌群通过调节免疫系统和炎症反应影响大脑功能。例如，某些菌属(如普雷沃菌属)可能通过促进促炎细胞因子的释放，引发系统性炎症反应，进而影响血脑屏障的通透性和神经元的活性。这种神经炎症反应可能是抑郁症的重要病理机制之一。未来的研究可以进一步探讨特定菌属如何通过调节免疫系统影响神经炎症，并开发针对性的抗炎治疗策略。本研究发现双歧杆菌属在健康对照组中显著富集，提示益生菌可能在维持肠道健康和情绪调节中发挥重要作用。近年来，多项临床试验表明，益生菌(如双歧杆菌和乳酸杆菌)和益生元(如低聚果糖)可能通过调节肠道菌群，改善抑郁症状。未来的研究可以进一步探索益生菌和益生元在抑郁症治疗中的潜力，并优化其使用方案。肠道菌群的组成和功能具有高度的个体差异性，这可能解释了为什么不同患者对相同的抗抑郁治疗反应不同。未来的研究可以结合多组学技术(如宏基因组学、代谢组学和转录组学)，开发基于肠道菌群的个性化治疗方案。例如，通过分析患者的肠道菌群特征，选择最合适的益生菌或益生元干预策略，以提高治疗效果。

5. 结论

本研究通过分析16S扩增子测序数据，成功鉴定了青少年抑郁症患者的肠道菌群特征及其潜在的生物标志物。研究结果表明，青少年抑郁症患者的肠道菌群多样性显著降低，且菌群组成和代谢功能与健康对照组存在显著差异。通过线性判别分析和随机森林模型，我们鉴定出了一些在抑郁症患者中显著富集的菌属，如普雷沃菌属、戴阿利斯特杆菌属和拟杆菌属，这些菌属可能与抑郁症的炎症反应、代谢紊乱和肠道屏障功能失调密切相关。

此外，代谢通路分析揭示了抑郁症患者在氨基酸代谢、脂肪酸代谢和厌氧代谢方面的显著变化，提示肠道菌群在抑郁症的病理生理过程中可能通过调节神经递质平衡、能量代谢和免疫反应等机制发挥作用。微生物共存网络分析进一步揭示了抑郁症患者肠道菌群中物种间的相互作用关系，特别是普雷沃菌属和拟杆菌属在抑郁症中的潜在作用。

综上所述，本研究为理解肠道菌群在青少年抑郁症发病机制中的作用提供了新的证据，并鉴定了潜在的生物标志物。这些发现为未来开发基于肠道菌群的抑郁症诊断和治疗方法提供了重要的理论依据。未来的研究可以进一步探索这些菌属的功能及其在抑郁症中的具体作用机制，为抑郁症的精准治疗提供新的思路。

基金项目

重庆市自然科学基金面上项目(cstc2021jcyj-msxmX0848)和重庆市璧山科研项目(BSKJ2022006)资助，大学生创新创业项目(202310617015, S202310617003, S202410617021)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。

参考文献