1. 引言

非酒精性脂肪性肝病(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD)是一种由多因素引起的疾病，特征为肝细胞内脂肪过度沉积，这种现象的出现需要在排除其他潜在因素后进行诊断。NAFLD的表现形式多样，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化，严重时可发展为肝硬化和肝细胞癌，最终导致肝功能衰竭和肝移植[1]。NAFLD的发病率增加与肥胖病的流行以及随之而来的新陈代谢紊乱有关。目前NAFLD影响全球约30%的人口，而在中国成人中，该病的患病率也高达29.2%，是一个全球性健康问题[2]。目前尚未有特效药物可供治疗，现行的治疗方法主要依赖于饮食和运动干预，以此来改善患者的生活方式和健康状况[3]。与此同时，中医药的研究也逐渐引起了重视[4]，特别是茵陈和荷叶[5] [6]，这两种中药在NAFLD的治疗中展现出了独特的效果，尽管其具体作用机制尚未充分阐明。此外，网络药理学作为一种新兴的研究工具，越来越多地被应用于中医药的价值评估和机制研究。这种方法不仅能帮助我们深入理解中医药的治疗机理，还能探寻新的潜在治疗方案[7] [8]。因此，本研究的核心目标是利用网络药理学方法，深入探讨茵陈和荷叶在治疗NAFLD方面的机制，希望能够为NAFLD的治疗提供新的参考方案和思路。

2. 材料与方法

2.1. 茵陈–荷叶成分的收集

分别以茵陈、荷叶为对象，在TSCMSP中药数据库(https://old.tcmsp-e.com/load_intro.php?id=29) [9]筛选茵陈、荷叶成分，参考TCMSP数据库使用指南，以OB (Oral Bioavailability) ≥ 30%，DL (Drug Like) ≥ 0.18为筛选标准，筛选茵陈和荷叶的有效活性成分。在UniProt数据库(http://www.uniprot.org)获得标准化基因名。

2.2. 茵陈–荷叶作用靶点的收集

基于前述筛选出的有效成分，我们将进一步收集茵陈和荷叶的潜在作用靶点，并在UniProt数据库中对相关靶点的简称进行修正。之后，我们还将利用SWISS Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)来补充和完善茵陈及荷叶的靶点信息。

2.3. NAFLD靶点的收集

通过在GeneCards (https://www.genecards.org/)和OMIM (https://omim.org/)疾病数据库中使用“Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD)”这一关键词进行搜索，获取了关于NAFLD的相关靶点信息。

2.4. 预测茵陈–荷叶对抗NAFLD的作用靶点

将茵陈、荷叶与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的靶点分别输入到Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)进行分析，绘制韦恩图，以识别茵陈与荷叶之间，以及茵陈与荷叶共同作用于NAFLD的交集靶点。这些交集靶点可能是茵陈和荷叶对抗NAFLD作用的重要靶点。

2.5. 蛋白相互作用(PPI)网络的构建

STRING数据库(https://cn.string-db.org/)能够汇集靶点信息并生成基础的蛋白质–蛋白质相互作用(PPI)网络图。通过输入茵陈和荷叶与非酒精性脂肪肝病(NAFLD)相关的交集靶点，可以获得相应的PPI网络及其数据信息。接着，这些数据可以被导入到Cytoscape 3.10.3可视化软件中，以优化PPI网络图，去除游离节点，并借助CytoHubba插件对关键靶点进行深入分析，以获取更为详细的靶点信息。

2.6. GO和KEGG富集分析

利用Metascape (https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)以及微生信富集分析平台 (https://www.bioinformatics.com.cn)，对茵陈–荷叶与非酒精性脂肪肝病(NAFLD)之间的主要生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)及关键通路进行了深入分析。通过这些分析，我们成功获取了茵陈–荷叶与NAFLD相关的作用通路，并制作了相应的通路分析气泡图和功能分析柱状图，以直观呈现相关的研究结果。

3. 结果

3.1. 茵陈–荷叶有效成分及靶点的筛选结果

在TCMSP数据库中对茵陈和荷叶的活性成分进行查找，其中茵陈有13种活性成分，其作用靶点为187个；荷叶有13种活性成分，其作用靶点为205个。合并去重后共得到24个潜在活性成分(见表1~2)及209个作用靶点。利用Cytoscape 3.10.3软件构建“茵陈–荷叶–有效成分–靶点”图，共239个节点，1186条边(见图1)。包括异鼠李素(Isorhamnetin)、β-谷甾醇(Beta-Sitosterol)、芫花素(Genkwanin)、乌药碱(Machiline)、荷叶碱(Nuciferin)、槲皮素(Quercetin)等。

Table 1. Potential active ingredients of Artemisiae scopariae

表1. 茵陈潜在活性成分

Table 2. Potential active ingredients of Folium nelumbinis

表2. 荷叶潜在活性成分

Figure 1. “Artemisiae scopariae-Folium nelumbinis-active ingredients-target” network diagram

图1. “茵陈–荷叶–有效成分–靶点”网络图

3.2. 茵陈–荷叶与NAFLD共同靶点的筛选结果

从GeneCards和OMIM数据库中筛选出NAFLD靶点4036个(去重后) (部分见表3)，经过分析，茵陈与荷叶的作用靶点以及茵陈–荷叶与非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的作用靶点分别被输入到Venny 2.1.0软件中进行处理。分析结果显示，茵陈和荷叶之间共有183个交集靶点(详见图2)，而茵陈–荷叶与NAFLD之间则有128个交集靶点(详见图3)。在这128个靶点中，有119个靶点可能被认为是茵陈–荷叶对抗NAFLD的潜在作用靶点，如NOS2、ESR1、AR、PPARG、PTGS2、PTPN1等。

Table 3. NAFLD partial targets

表3. NAFLD部分靶点

Figure 2. Artemisiae scopariae-Folium nelumbinis intersection target

图2. 茵陈–荷叶交集靶点

Figure 3. Artemisiae scopariae-Folium nelumbinis and NAFLD intersection targets

图3. 茵陈–荷叶与NAFLD的交集靶点

3.3. 茵陈–荷叶治疗NAFLD的靶点网络分析

通过对119个共同靶点的深入分析，利用STRING数据库成功构建了一个蛋白质–蛋白质相互作用(PPI)网络。在这个过程中，精细筛选数据，去除5个离散节点，最终确定了105个节点和432条边的网络结构(见图4)。通过对构建的PPI网络进行进一步评估，筛选出Degree值排名前3的靶点，分别为肿瘤抑制基因(抗原) (Cellulartumor Antigen p53, TP53)、RAC-α丝裂原活化蛋白激酶(RAC-Alpha Serine/Threonine-Protein Kinase, AKT1)、转录因子AP-1 (Transcription Factor AP-1, JUN)，提示这些靶点可能是茵陈–荷叶治疗NAFLD的核心靶点。

Figure 4. Artemisiae scopariae-Folium nelumbinis target protein PPI network

图4. 茵陈–荷叶靶点蛋白PPI网络

3.4. GO富集与KEGG通路分析

将从韦恩图得到的119个交集靶点导入Metascape富集分析平台进行富集分析，得到GO与KEGG数据。导入微生信在线数据库中进行GO富集，根据P值 < 0.01筛选出：生物过程10个(Biological Process, BP) (主要涉及耐受性诱导、T细胞耐受性诱导的调节、肽类激素处理等)，细胞质组成10个(Cellular Component, CC) (主要涉及轴丝动力蛋白复合体、质膜、细胞质等)，分子功能10个(Molecular Function, MF) (主要涉及细胞因子活性、相同蛋白质结合等)，并在微生信作图网络中作出其GO功能富集结果水平柱状图(见图5)。

注：上图表示BP富集分析结果；中图表示CC富集分析结果：下图表示MF富集分析结果；横坐标表示富集基因数目。

Figure 5. Horizontal histogram of GO enrichment results of potential action targets

图5. 潜在作用靶点GO富集结果水平柱状图

利用Metascape数据库对潜在靶点进行KEGG通路分析，共富集到189条信号通路，对排名前20条的信号通路通过微生信在线数据库进行KEGG富集，绘制成气泡图(见图6)，其中主要包括白介素-17信号通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路等。综上所述，茵陈–荷叶是通过以上多个通路治疗NAFLD。

4. 讨论

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)作为代谢性疾病在肝脏的集中体现，其发病机理主要涵盖两大类：一是原发性代谢功能紊乱，二是肝内脂肪异常累积。依据中医理论，NAFLD的病理基础涉及“湿浊”、“痰凝”与“血瘀”，《素问·灵兰秘典论》有云：“肝者，将军之官，谋虑出焉。”意指肝脏功能与健康息息相关。茵陈归肝胆经，性微寒，味苦辛；荷叶归肝脾经，性平，味苦。茵陈苦寒能清热利湿，疏肝利胆，促进胆汁排泄，有助于消除肝胆湿热；荷叶苦平，既能清暑利湿，又能升发清阳，活血化瘀，尤善调理肝脾功能，促进体内湿浊排出。两药合用，共奏清肝利胆、活血化瘀、利湿消浊之功。

本次研究基于网络药理学的分析方法，剖析茵陈–荷叶治疗NAFLD的作用机制，共得到24种有效活性成分。在茵陈的成分中，异鼠李素通过降低氧化应激的作用，改善肝细胞脂质沉积的游离脂肪酸诱导[10]。槲皮素通过AMPK介导的线粒体自噬，阻止NAFLD [11]。β-谷甾醇可减轻酒精引起的氧化应激[12]。

Figure 6. Kyoto encyclopedia of genes and genomes

图6. KEGG通路富集气泡图

在荷叶的成分中，荷叶碱激活ALP改善肝脂肪变性和胰岛素抵抗[13]。山奈酚可能通过增加CYP27A1和NTCP来减轻NASH以增强BA转运[14]。这些预测结果与当前的研究发现相一致，表明这些成分可能在茵陈和荷叶对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的治疗中发挥着重要作用，因此具有显著的研究价值。

由PPI网络可知，茵陈–荷叶治疗NAFLD的核心靶点为TP53、AKT1、JUN。TP53在促进细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、细胞衰老方面发挥重要作用；AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞生理中发挥着核心作用[15]；JUN参与调控多种生物过程，包括生长因子信号传导、代谢、细胞增殖、炎症和血管生成等[16]。

GO富集分析主要涵盖了多个生物过程，包括糖脂代谢、氧化应激、炎症反应，以及细胞的增殖与凋亡。这些过程在调控脂质代谢及相关信号通路方面发挥重要作用，尤其是在动脉粥样硬化、内分泌抵抗、乙型肝炎和丙型肝炎等疾病的背景下，有助于减少肝脏内脂质的积累。这一结果表明，茵陈–荷叶药物确实在非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的治疗中具有积极的作用[17]。

5. 结语

综上所述，本文的研究结果进一步表明，茵陈–荷叶的主要活性成分与其靶点之间存在显著的关联性，并且它们能够通过多种途径对非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)进行有效治疗。

基金项目

全国中医临床优秀人才研修项目(编号：国中医药人教函[2022] 1号)；2022年广西岐黄学者建设项目(桂中医药科教发[2022] 10号)。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献