1. 引言
胎盘植入(PAS)是妊娠的严重并发症，穿透性胎盘植入是PAS中最严重的类型，由于高龄孕妇、多次分娩以及有剖宫产史和刮宫史等因素的影响，侵袭性胎盘的发生率显著增加[1] [2]。胎盘侵袭深度及其与相邻组织的关系决定了所需干预水平的高低。早期诊断和非侵入性干预对于减轻疾病进展、降低与侵入性治疗相关的创伤，甚至保留生育能力至关重要[3]。
目前，结合超声和磁共振成像技术与临床危险因素的诊断策略受到ACOG和FIGO等组织的强烈推荐[4]。值得注意的是，由于不同地区医疗水平的差异，在欠发达地区有效实施上述基于影像的诊断策略和综合管理仍然具有挑战性。虽然影像在评估该疾病和确定其严重程度方面起着至关重要的作用，但在提供预防性诊断及并发症方面表现不足。胎盘植入谱系的生物标志物和干预靶点可以有效地补充现有的诊断和治疗策略[5]。
蜕膜层和子宫肌层中免疫环境的动态改变是胎盘细胞侵入和转化的重要过程[6]。过去的研究已经突出显示了子宫肌层中免疫细胞浸润的变化，特别是着重于穿透性胎盘植入的病理学改变[7]。此外，像CXCL8这样的免疫相关基因引起了研究人员的关注[8]。然而，迄今为止，尚缺乏试图从免疫学角度对穿透性胎盘植入潜在生物标志物进行研究。
本研究的目的是通过生物信息学分析确定穿透性胎盘植入的潜在免疫相关生物标志物。具体来说，我们分析了基因的差异表达，并进行了基因集富集分析(WGCNA)以确定与穿透性胎盘植入最相关的基因簇。然后，我们将从上述分析中获得的基因与从在线数据库中获取的免疫相关基因相交。随后，进行了基因本体论和基因组学分析，以探讨穿透性胎盘植入的潜在生物学机制。此外，利用基因集富集分析(GSEA)探索了枢纽基因参与的潜在生物过程。
2. 资料与方法
2.1. 微阵列数据源
从基因表达综合数据库(GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)下载数据集GSE189267。共纳入了11份样本，正常妊娠胎盘3份，穿透性胎盘植入6份，胎盘植入2份。下载数据集后，用GPL (GPL16686)文档进行基因名称转换。从ImmPort数据集(https://www.immport.org/shared/home)中共获得1793个免疫相关基因。采用R语言软件(“limma”R包)对各组表达基因进行差异分析，筛选出有差异意义的差异表达基因(DEGs)。当P < 0.01，|logFC| > 0.05时差异具有统计学意义，该标准筛选出的样本被视为进一步分析的DEGs。
2.2. 功能富集分析
采用David数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析，当P < 0.05时具有统计学意义。
2.3. 加权基因表达网络分析
利用加权基因表达网络分析(WGCNA)找出与不同性状密切相关的模块。本研究采用“WGCNA”R包进行WGCNA，其中选择矩阵中表达量排名前5000的基因进行WGCNA。然后，选择最优的软阈值形成一个邻接矩阵，并从邻接矩阵中创建一个拓扑重叠矩阵(TOM)。采用基于TOM的相位差异度量来检测具有相似表达模式的基因。选择与穿透性胎盘植入相关性最强的模块作为后续分析的关键模块，正相关性和负相关性最高的三个模块如图3所示。最后，将上述高相关模块中的基因与DEGs相交。
2.4. 蛋白质相互作用网络分析
利用string数据库(https://string-db.org/)进行蛋白质相互作用网络，并下载结果进行进一步分析。
2.5. 模块基因鉴定
利用Cytoscape软件鉴定了DEGs的枢纽基因。具体来说，利用string数据库构建上述获得的基因网络，结合centiscape 2.2和cytohubba计算前10个枢纽基因。
2.6. 基因集富集分析(GSEA)
采用GSEA软件4.3.2进行基因集富集分析。以上述获得的枢纽基因作为表型，根据基因集分析数据，排列时间设置为1000次，采用皮尔逊方法对排序基因进行度量。检索基因集“c5.go.v7.2.symbols.gmt”进行GSEA分析。FDR < 0.05的结果具有统计学意义，对分析的归一化富集评分(NES)进行排序，排名前三的KEGG通路如图6所示。
3. 结果
3.1. 差异表达基因的鉴定与功能分析
在穿透性胎盘植入组与正常组的比较中，共鉴定出327个差异表达基因(47个上调，280个下调)。与正常组相比，植入性胎盘组共鉴定出209个差异表达基因(68个上调，141个下调)。此外，穿透性胎盘植入组与植入性胎盘组相比较共鉴定出124个差异表达基因(46个上调，78个下调，显示所有DEGs的热图如图3(A)所示)。差异基因的火山图见图1(A)~(C)。
(A)~(C) 正常组与穿透性胎盘植入组、正常组与胎盘植入组、穿透性胎盘植入组与胎盘植入组的差异基因分析结果，红点代表上调基因，蓝点代表下调基因。(D) (E) GO分析揭示了与正常妊娠相比，发生胎盘植入与穿透性胎盘植入的潜在机制，橙色注释为生物过程，绿色注释为细胞成分，蓝色注释为分子功能。(F) 通过交叉穿透性胎盘植入与胎盘植入的差异基因得到93个共表达的差异基因，用韦恩图表示。(G) 对共表达基因进行GO分析。
Figure 1. Acquisition and functional analysis of differential genes
图1. 差异基因的获得与功能分析
为了进一步了解差异表达基因的功能，我们进行了基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径富集分析。与正常组相比，穿透性胎盘植入组与正常组相比，排名前5的生物过程为：女性妊娠、多细胞生物过程、生长激素受体信号通路、细胞对生长激素刺激的反应和生殖结构发育(图1(D))。在KEGG通路分析中，这些差异表达的基因在JAK-STAT信号通路、PI3K-AKT信号通路、癌症中的蛋白多糖合成、甲状旁腺激素合成、分泌和作用、HIF-1信号通路等通路中显著富集(图2(A))。
植入性胎盘组与正常组的分析结果显示，排名前5的生物过程为：女性妊娠、多细胞生物过程、转化生长因子的正调控、生长激素受体信号通路和细胞对生长激素刺激的反应(图1(E))。KEGG通路分析显示，这些差异表达的基因在细胞因子–细胞因子受体相互作用、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体相互作用、PI3K-AKT信号通路等通路中显著富集(图2(B))。
上述两组差异基因交叉得出93个共有差异基因(图1(F))，排名前5的生物过程是生长激素受体信号通路、细胞对生长激素刺激的反应、女性妊娠、生长激素的反馈和多细胞生物过程(图1(G))。排名前5的KEGG途径分别是生长激素的合成、分泌和作用、细胞因子–细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路、粘附连接和PI3K-AKT信号通路(图2(C))。
(A) 穿透性胎盘植入组与正常组间差异基因的KEGG分析结果。(B) 胎盘植入组与正常组间差异基因的KEGG分析结果。(C) 穿透性胎盘植入组与胎盘植入组间共表达差异基因的KEGG分析结果。
Figure 2. Results of the KEGG analysis of the DEGs
图2. 差异基因的KEGG分析结果
3.2. 穿透性胎盘植入与植入性胎盘组间潜在的不同机制
通过对穿透性胎盘植入和植入性胎盘组的差异基因进行GO和KEGG分析，确定了前五个富集的生物过程：血液循环负调控、脂肪组织发育、锌离子反应、心脏收缩负调控、p38MAPK级联正调控(图3(B))。此外，KEGG分析显示，这些差异表达的基因在钙信号通路、矿物质吸收、药物代谢–其他酶和Gap连接等通路中显著富集(图3(C))。
(A) 11个胎盘样本中差异基因的表达水平，红色为上调，蓝色为下调。(B) 穿透性胎盘植入与胎盘植入间差异基因的GO分析结果。(C) 穿透性胎盘植入与胎盘植入中共表达差异基因的前五个KEGG富集通路。
Figure 3. The differences between placental implantation and placenta percreta
图3. 胎盘植入与穿透性胎盘植入间的差异
3.3. 与穿透性胎盘植入高度相关的免疫相关差异基因的鉴定
本研究中的软阈值功率被校准为13 (自由度R2 = 0.90) (图4(A)，图4(B))。随后进行动态树切割，并分析每个模块的相关性(图4(C)，图4(D))。然后检验模块–性状关系，当P < 0.05时有统计学意义。利用该标准，共鉴定出9个模块(图4(E))。值得注意的是，Whitesmoke模块(cor = 0.56, P = 0.004)、Honeydew模块(cor = 0.61, P = 0.01)和Magenta1模块(cor = 0.59, P = 0.03)分别与穿透性胎盘植入表现出强烈的正相关(图4(F))。相反，Blue3模块(cor = −0.21, P = 0.04)、Plum4模块(cor = −0.68, P < 0.01)和Orangered3模块(cor = −0.2, P = 0.02)与穿透性胎盘植入呈很强的负相关(图4(G))。此外，我们还发现有5个模块与胎盘粘连有很强的相关性。由于本研究的主要重点是穿透性胎盘植入，因此我们只选择了与穿透性胎盘植入高度相关的模块进行进一步研究。
此外，将免疫相关基因、相关度最高的模块基因和穿透性胎盘植入差异表达基因(DEGs)交叉后，鉴定出17个基因作为进一步分析的候选基因(图4(H))。
3.4. 模块基因的鉴定
利用Cytohubba插件识别程度最高的十大枢纽节点(图5(A))，包括瘦素(LEP)、绒毛膜生长激素1 (CSH1)、绒毛膜生长激素2 (CSH2)、生长激素2 (GH2)、表皮生长因子受体(EGFR)、生长素M受体(OSMR)、集落刺激因子3受体(CSF3R)、胰岛素受体(INSR)、血栓反应蛋白1 (THBS1)和生长分化因子15 (GDF15)。各模块基因的表达水平如图5(B)所示。
(A) (B) WGCNA的软阈值的设定标准。(C) WGCNA的动态树切割。(D) 不同模块之间的相关性。(E) 当P < 为0.05时，鉴定出9个与穿透性胎盘植入相关的基因模块，其中深红色表示正相关，深绿色表示负相关。(F) 与穿透性胎盘植入相关的前三个正相关模块。(G) 与穿透性胎盘植入相关的前三个负相关模块。(H) 韦恩图显示17个免疫相关的差异基因与穿透性胎盘植入高度相关。
Figure 4. Immunological differential genes highly associated with placenta percreta
图4. 与穿透性胎盘植入高度相关的免疫差异基因
(A) Cytohubba分析得出排名前十的枢纽基因。(B) 正常组和穿透性胎盘植入组枢纽基因的表达水平。
Figure 5. Hub genes and expression levels
图5. 枢纽基因及其表达水平
(A) LEP的GSEA分析结果。(B) CSH1的GSEA分析结果。(C) CSH2的GSEA分析结果。
Figure 6. GSEA analysis of the top three hub genes
图6. 排名前三枢纽基因的GSEA分析
3.5. 基因集富集分析(GSEA)
选择富集程度前3的基因进行进一步的单基因GSEA。首先，LEP的分析结果表明，LEP可能参与了膜裂变、多泡体组织和核膜重组等生物过程(图6(A))。CSH1可能参与了机体形态发生、RAC蛋白信号转导和SRP依赖的细胞膜靶向的共翻译蛋白等生物过程(图6(B))。同样，CSH2可能参与了细胞膜靶向的共翻译蛋白、调控RAC蛋白信号转导以及细胞膜靶向的SRP依赖的共翻译蛋白(图6(C))。
4. 讨论
胎盘植入谱系包括三种不同类型，其特征在于对子宫肌层的侵袭深度：胎盘粘连、植入性胎盘以及最严重的穿透性胎盘植入，涉及绒毛穿透整个子宫肌层的厚度[9]。全球范围内，穿透性胎盘植入对孕妇和胎儿的死亡率构成重大风险。在关于胎盘的研究中，人们充分认识到免疫相关因素的关键作用，例如滋养层免疫细胞比例的变化和异常细胞因子分泌，它们改变了滋养细胞的活力和侵袭能力[10]。然而，迄今为止，还缺乏以生物信息学方法为目的的研究，以及确定穿透性胎盘植入的潜在生物标志物。在本研究中，我们进行了基因差异表达分析和加权基因共表达网络分析，以确定与穿透性胎盘植入强相关的枢纽基因，包括LEP、CSH1、CSH2、GH2、EGFR、OSMR、CSF3R、INSR、THBS1和GDF15。此外，进行了功能分析，以探索穿透性胎盘植入潜在的病理机制。我们的研究结果表明，这些被鉴定的基因可能代表着干预的新靶点，其中排名前三的枢纽基因(LEP、CSH1、CSH2)可能通过调节RAC蛋白和SRP依赖的共转译蛋白来参与疾病的发展。这些发现可能为穿透性胎盘植入的治疗管理提供新的视角。
对不同组进行的基因本体论分析阐明了穿透性胎盘植入各亚型的潜在机制。对比穿透性胎盘植入、植入性胎盘和正常妊娠胎盘的分析表明，生长激素(GH)的产生和响应可能在疾病的发展中起到重要作用。正如其名称所暗示的那样，GH在各种器官的生长和发育以及性别分化和性腺类固醇合成过程中发挥关键作用。以往的研究主要集中在垂体GH的直接内分泌作用或其介导肝脏或局部胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)产生方面[11]。IGF-1是一种单链多肽，它通过与其受体结合形成IGF轴来响应一系列环境信号[12]。此外，人们对GH在子宫内调控和滋养细胞能量获取方面的功能越来越关注[13]。将这些发现与穿透性胎盘植入和植入性胎盘之间比较的KEGG分析结果相结合，可以明显看出，在不同水平的胎盘植入中，GH的合成、分泌和作用存在差异。这些证据支持了GH可能通过调节生殖系统功能或细胞对GH刺激的反应来影响疾病发展的假设。
我们的数据强调了转化生长因子β (TGFβ)在胎盘生物学中的重要性，尤其是在共表达差异表达基因(DEGs)的基因本体论分析中得到的数据，这一点特别突出。其关键在于破坏滋养细胞的发育程序，这对于它们从固定绒毛向滋养细胞内的血管和滋养细胞内的腺体的迁移至关重要，被认为是各种胎盘源性疾病的基础。TGFβ及其受体和下游效应物，在妊娠疾病(如子痫前期)中已得到广泛研究。当前的研究提供了证据表明，TGFβ/UCHL5/Smad2轴可能通过调节滋养细胞的侵袭能力，主要是通过调节滋养细胞的侵袭能力，从而促进穿透性胎盘植入的发病机制[14] [15]。然而，其作用并不限于此机制。此外，以前的研究表明，TGFβ1在患有穿透性胎盘植入的妊娠妇女的血清中显著升高[16]。我们的研究结果支持了TGFβ在穿透性胎盘植入的发病机制中发挥有利作用的普遍认识。因此，人们应更为关注以TGFβ相关药物为基础的干预措施，包括激动剂和拮抗剂。
穿透性胎盘植入的确切发病机制仍然神秘；然而，细胞因子相互作用已经成为关键的促进因素。它们刺激固有免疫系统并促进随后的炎症过程，从而促进疾病的进展。细胞间的粘附连接在调节屏障功能和血管生成方面起着至关重要的作用。最近的研究表明，细胞间的粘附连接可能也会对滋养层细胞的合胞体化起到一定的影响[17]。对于滋养层细胞而言，细胞间粘附连接可能会影响合胞体化的发生率。与以往研究不同，我们的研究进一步指出，在穿透性胎盘植入中，细胞因子相互作用和细胞间粘附连接的水平和功能强度存在差异，并且随疾病严重程度的变化而变化。这加深了我们对穿透性胎盘植入病理机制的理解。JAK-STAT (Janus激酶–信号转导子与转录激活子)和PI3K-AKT (磷酸肌醇3激酶–蛋白激酶B)在细胞信号传导中起着关键作用，它们经常相互交叉调节，以调控生理和病理过程，如细胞增殖和迁移、血管生成和免疫调节[18] [19]。然而，这些途径在穿透性胎盘植入中的潜在意义仍然存在争议，需要进一步探讨其在该疾病中的作用。
在穿透性胎盘植入中，一些关键基因的作用仍然尚未阐明。瘦素(LEP)是一种已知的胎盘激素，在因滋养层和胎盘功能受损而表现出的疾病中，如先兆子痫中已经得到了广泛的研究[20]。多个生物信息学分析表明，LEP的上调在先兆子痫的进展和诊断中可能起到关键作用。观察性研究提供的证据表明，母体血清中LEP的过度表达与先兆子痫和胎儿生长受限均有关联[21]。与先兆子痫相比，穿透性胎盘植入表现出增强的滋养层活性[22]。有趣的是，我们的数据显示穿透性胎盘植入中LEP的显著下调，这与穿透性胎盘植入的病理机制一致。因此我们推测，当LEP表达下降时，胎盘滋养层细胞的活性得到进一步激活，使得胎盘能更深入地生长到子宫肌层中，从而引起胎盘植入性疾病的发生。此外，我们的研究中的基因集富集分析(GSEA)表明，LEP可能参与膜裂解、多泡体组织和核膜重组。这些生物过程显著影响核膜重塑，在细胞分裂和增殖过程中促进染色体分离。LEP在先兆子痫的胎盘组织中存在过度表达，与先兆子痫相比，胎盘植入性疾病存在相反的调节机制，当LEP下调时，膜裂解与膜重组的生物过程更活跃，加强了局部胎盘小血管重建，这为胎盘进一步往子宫肌层深部生长这一过程提供了进一步的生物学基础[23]。这需要进一步的机制研究来探索LEP与这些过程之间的因果关系。
从机制的角度来看，CSH1和CSH2基因编码一种被称为绒毛膜生长激素的蛋白，它在胎盘代谢和发育中起着重要作用[24]。与LEP类似，CSH1和CSH2在先兆子痫和胎儿生长受限的进展中被认为是关键因素[25]，但它们在穿透性胎盘植入中的作用尚未得到充分研究。我们的数据显示穿透性胎盘植入中CSH1和CSH2下调，而先前的研究已经报道了在先兆子痫患者的胎盘中这些基因的类似下调。根据现有证据，我们假设存在一个负反馈机制来调节穿透性胎盘植入中CSH1和CSH2的表达。然而，需要进一步的研究来探索穿透性胎盘植入患者的血浆和胎盘组织中CSH1和CSH2及其产物的表达水平对上述假设加以证实。此外，根据我们的基因集富集分析(GSEA)，CSH1和CSH2可能通过调节RAC蛋白和SRP依赖的共转译蛋白来影响疾病的进展。RAC蛋白属于Rho GTP酶超家族，在多种细胞过程中起着关键作用。研究人员观察到先兆子痫患者的RAC1活性明显降低，并且体外实验表明，RAC1对胰岛素样生长因子结合蛋白1 (IGFBP1)诱导的滋养层细胞迁移至关重要[26]。SRP依赖的共转译蛋白是指其翻译和折叠过程依赖于信号识别粒子(SRP)在核糖体合成过程中的合成。SRP识别新生多肽从核糖体上出现的信号序列，并将其靶向到内质网(ER)膜上进行进一步的处理和折叠。这个过程对于许多蛋白质的正确折叠、定位和功能至关重要，特别是对于那些注定要分泌、插入或整合到细胞器的蛋白质。在胎盘发育过程中，这些SRP依赖的蛋白质可能在调节胎盘细胞的分化、功能和存活方面发挥作用。因此，它们可能通过影响胎盘的形成和功能而促进穿透性胎盘植入的发病机制。
我们承认我们目前研究中存在一些局限性。首先，我们的结论在很大程度上依赖于原始微阵列数据集的准确性和可靠性。其次，虽然我们利用了穿透性胎盘植入病例的胎盘组织进行了生物信息学分析，但由于样本量相对较小，因此可能受到限制。因此，有必要进一步利用蛋白印迹、qPCR和ELISA对穿透性胎盘植入患者的胎盘组织和血清样本进行进一步的实验验证。此外，对枢纽基因及其调控机制的功能进行额外的实验研究对于阐明这些各种因素之间的因果关系是至关重要的。
5. 结论
本研究通过生物信息学方法提示LEP、CSH1和CSH2是穿透性胎盘植入的关键免疫基因，可能通过膜裂解、多泡体组织和核膜的重组、调节RAC蛋白信号转导和SRP依赖的共转译蛋白质膜定位等机制参与穿透性胎盘植入的发生，有助于更深入地理解穿透性胎盘植入，并为该疾病的潜在诊断和治疗靶点提供了进一步的见解。此外，我们预测了不同类型穿透性胎盘植入的潜在机制。这些预测将在未来通过实验研究进一步验证。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。