1. 引言

冠心病心绞痛(以下简称：心绞痛)是由于冠状动脉供血不足，心肌急剧而短暂的缺血与缺氧所致，以发作性的心前区疼痛为主要的临床特点，包括稳定型与不稳定型[1]。随着社会经济的快速发展，人口老龄化日益严重，加之不良的生活方式，使疾病的发病率和死亡率逐年上升，并逐渐趋向于年轻化，给国家医疗卫生事业带来了更大的挑战。临床上，虽然心绞痛患者基本能长期生存，但发病时仍有发生心肌梗死或猝死的风险，尤以不稳定型心绞痛更为常见。为此预防和治疗心绞痛已成为亟待的医学问题。近年来，伴随医学技术的突飞猛进，中医药及其机制研究广泛用于指导临床，并取得了较理想的效果[2]。刺五加注射液主要成分由刺五加中药提取而来的灭菌溶液，其具有益气健脾、补肾安神、扶正固本的功效，且多项研究表明与其他药物联用更有益于改善心绞痛患者整体病情，辅助正气[3]-[5]。为此本研究采用网络药理学及分子对接技术对刺五加注射液治疗心绞痛的作用机制进行探讨与验证。

2. 资料与方法

2.1. 刺五加注射液化合物和靶点的收集与确定

通过ECTM (http://www.tcmip.cn/ETCM/)和文献检索后去重得到刺五加注射液的化学成分。利用ChemDraw软件绘制检索到化学成分结构式或利用PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索并保存其SMILES号。将SMILES号导入SwissADME (http://www.swissadme.ch/)进行筛选，以胃肠道吸收度为“High”，类药性满足两项以上“Yes”作为筛选条件。将符合标准的化合物通过SwissTargetPrediction (http://swisstargetprediction.ch/)进行靶点预测，以Probability > 0.1作为药物潜在靶点入选条件，最后将收集到的成分靶点导入Cytoscape3.9.1进行绘制化合物–靶点网络图。

2.2. 心绞痛的相关靶点收集

以“Angina Pectoris”为检索词，通过TTD (https://db.idrblab.net/ttd/)、DisGeNET (https://www.disgenet.org/)、GeneCards (https://www.genecards.org/)收集后去重得到心绞痛的相关靶点。

2.3. 心绞痛和刺五加注射液交集靶点获取

将获取靶点分别导入Venny2.0.2 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index2.0.2.html)，绘制Venny图。

2.4. 疾病–靶点–化合物网络的构建

将疾病名称–交集靶点–刺五加注射液的化合物导入Cytoscape3.9.1进行绘制心绞痛–交集靶点–刺五加注射液化合物网络图。

2.5. 潜在靶点的PPI网络构建

将得到的交集靶点利用STRING (https://cn.string-db.org/)，物种设置为“Homo sapiens”，获取TSV文件，将文件导入Cytoscape 3.9.1进行可视化分析，运用插件CentiScaPe2.2 Menu分析网络拓扑参数，以Degree、Closeness、Betweenness为筛选标准，进行核心靶点筛选。

2.6. GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

将心绞痛–刺五加注射液的核心靶点上传Metascape (https://metascape.org/)依次进行GO和KEGG富集分析，物种限定为“Homo sapiens”，阈值设定“P < 0.05”，并通过微生信平台 (https://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化。

2.7. 分子对接

在PDB (https://www.rcsb.org/)中选取关键靶点受体PDB格式。选取刺五加注射液的主要有效成分,并在pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得对应配体的sdf格式，将文件导入chem 3D中进行最小结合能优化，后保存为mol2格式。运用AutoDock Tools 1.5.7对配体进行去水，加氢等，利用Autodock vina 1.1.2进行分子对接，受体–配体的结合能小于4 kcal/mol，提示具有一定的结合活性，结合能越低，对接效果越好，最后利用Pymol2.5进行蛋白对接可视化分析。

3. 结果

3.1. 化合物–靶点图

筛选得到的39个化合物其中22个来自ECTM数据库，17个来自余文怡团队基于超高效液相色谱-四极杆–静电场轨道阱高分辨质谱联用(UHPLC-Q/Orbitrap HRMS)技术对刺五加注射液的化学成分进行定性分析[6] (成分具体信息见表1)，图1中共包括286个节点，696条边连接，39个化合物与247个靶点相关联，依据Degree值主要包括碳酸酐酶9 (CA9)、碳酸酐酶12 (CA12)、碳酸酐酶1 (CA1)、碳酸酐酶2 (CA2)、碳酸酐酶7 (CA7)、碳酸酐酶14 (CA14)、羟基类固醇11-β脱氢酶(HSD11B1)、碳酸酐酶6 (CA6)、碳酸酐酶5A (CA5A)、维生素D受体(VDR)等靶点(见图1)。

Table 1. Main components of Eleuthero injection

表1. 刺五加注射液主要成分

“V”形节点代表刺五加注射液的化合物，圆形表示化合物靶点，Degree值越大图形越大，颜色越深。

Figure 1. A compound-target plot

图1. 化合物–靶点图

3.2. 绘制Venny图

在TTD数据库中获得40个疾病相关靶点；在DisGeNET数据库中获得139个疾病相关靶点；在GeneCards数据库中获得4561个疾病相关靶点，依据score值取两次中位数后保留1141个疾病相关靶点，其中TTD数据库与DisGeNET数据库共有4个交集靶点，TTD数据库与GeneCards数据库共有15个交集靶点，DisGeNET数据库与GeneCards数据库共有92个交集靶点(见图2)。三者合并去重后1211个心绞痛的相关靶点并与248个刺五加注射液的相关靶点分别导入作图网站，中间交集的部分就是心绞痛和刺五加注射液的共同靶点(见图3)。

Figure 2. The intersection plot of the database targets

图2. 数据库靶点交集图

Figure 3. Venny plot of the intersection of angina and Eleuthero injection

图3. 心绞痛和刺五加注射液交集靶点Venny图

3.3. 疾病–靶点–化合物网络图构建

图中共包括110个节点，259条边连接，包括39个化合物与71个交集基因相关联(见图4)。

3.4. 核心靶点的筛选与PI网络构建

筛选后网络包括19个节点，163条边核心靶点分别为肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素6 (IL6)、核因子kappa B (NF-κB)、表皮生长因子受体(EGFR)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)、胱天蛋白酶3 (CASP3)、前列腺素内过氧化物合酶2 (PTGS2)、基质金属蛋白酶9 (MMP9)、雌激素受体(ESR1)、缺氧诱导因子1亚基α (HIF1A)、血管紧张素转化酶(ACE)、完全纤溶酶原激活物抑制剂1 (SERPINE1)、重组人白介素1 beta (IL1B)、海肾荧光素酶(REN)、淀粉样前体蛋白(APP)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARG)、Toll样受体4 (TLR4)、过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARA)、白细胞介素8 (CXCL8) (见图5)。

Figure 4. Network diagram of angina-intersection target-Eleuthero injection compound

图4. 心绞痛–交集靶点–刺五加注射液化合物网络图

Figure 5. Screening flow chart of core targets and PPI network map (Degree value is proportional to size color)

图5. 核心靶点的筛选流程图与PPI网络图(Degree值与大小颜色成正比)

3.5. GO富集分析

通过Metascape数据库对19个核心靶点进行GO基因功能分析，共获得576个GO条目，包括生物过程(BP) 533个，主要富集于对内毒素的反应、对细菌来源的分子的反应、细胞对脂质的反应、对细菌的反应、炎症反应的调节、对多肽的反应、细胞迁移与运动的正向调节；细胞成分(CC) 17个，包括受体复合体、膜筏、膜微域、质网腔、早期内体、核膜、胞浆核周区、囊泡腔、分泌颗粒腔、胞浆囊泡腔等；以及分子功能(MF) 26个，主要为信号受体激活与调节活性、细胞因子活性、受体配体活性、核受体活性、转录共调节因子与转录辅活化子结合、蛋白结构域特异性结合等方面。按P值大小，分别对前10个条目进行可视化(见图6)。

Figure 6. Dot-line plot of the GO enrichment analysis

图6. GO富集分析点线图

3.6. KEGG富集分析

通过Metascape数据库对19个核心靶点进行KEGG基因功能分析，共获得75个KEGG条目，主要富集的前20条信号通路包括：IL-17信号通路、恰加斯病、军团杆菌病、脂质与动脉粥样硬化、酒精性肝病、百日咳、非酒精性脂肪性肝病、高级糖基化终末产物–受体(AGE-RAGE)信号通路、阿米巴病、肿瘤坏死因子信号通路、人巨细胞病毒感染、冠状病毒病–新冠肺炎、乙型肝炎、甲型流感、致病性大肠埃希菌感染、核因子kappa B信号通路、Toll样受体信号通路、沙门氏菌感染、疟疾、耶尔森氏菌感染(如图7)。

3.7. 分子对接结果

依据PPI网络中核心靶点度值大小，选取前20核心效活性成分与前2的TNF，IL6核心靶点进行分子对接。结果显示平均结合能为−6.97 kcal/mol (见表2)。分贝选取每个核心靶点结合排名前3的进行可视化处理(见图8)。

Figure 7. Matrix dot plot of KEGG enrichment analysis

图7. KEGG富集分析矩阵点图

Table 2. Results of molecular docking

表2. 分子对接结果

Figure 8. Molecular docking results figure

图8. 分子对接结果图

4. 讨论

本研究采用了网络药理学的方法共收集与筛选刺五加注射液39个化合物及248个相关靶点，心绞痛1211个相关靶点，二者映射取交集后共获得71个交集靶点。通过PPI网络图的筛选与构建共获得核心靶点19个，包括肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6 (IL6)、核因子kappa B亚基1 (NFKB1)、表皮生长因子受体(EGFR)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)、胱天蛋白酶3 (CASP3)、前列腺素内过氧化物合酶2 (PTGS2)、基质金属蛋白酶-9 (MMP9)、雌激素受体1 (ESR1)、缺氧诱导因子1亚基α (HIF1A)、血管紧张素转化酶(ACE)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(SERPINE1)、白细胞介素-1β (IL1B)、海肾荧光素酶(REN)、淀粉样前体蛋白(APP)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARG)、Toll样受体4 (TLR4)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARA)、白细胞介素8 (CXCL8)。

研究表明稳定型和不稳定型心绞痛的TNF-α浓度与对照组相比具有显著性，指出TNF-α指标常被认为用于心绞痛的显著标志物[7]；TNF在机体免疫防御功能中既可作为机体的损伤与炎性反应指标，还可对IL-6、CXCL8等因子产生诱导作用，将血管内皮细胞损伤并快单核细胞黏附血管内皮细胞，在心绞痛发病过程发挥重要预测作用[7]-[9]。NFKB1是一种转录因子，常见于多种细胞中，对基因转录表达具有调控作用，进而调控趋化因子和细胞因子的基因转录[10]。活化的NF-κB指标存在动脉粥样硬化斑块中，并且能促进促炎因子和下游靶细胞因子的表达，如IL-6、TNF、IL1B等，从而导致细胞凋亡和损伤，内皮细胞功能障碍，进而增加对冠心病的发病率，此研究表明NFKB1基因在冠心病发病机制发挥着重要的预测作用[11]。HIF-1A被认为是调节缺氧信号的主要因子，其在细胞增殖、分化、迁移及凋亡等多个细胞过程中具有调节作用[12] [13]。Sadiya S Khan等指出SERPINE1的遗传缺陷是早发性心脏纤维化相关联，从而表明人类心脏稳态需要SERPINE1的正常表达[14] [15]。通过分析单核苷酸多态性(SNP)与冠心病的相关性，得出了PPARG、CXCL16等基因存在相互作用并在冠心病的发病中发挥着一定的作用[16]，通过对PPARA，PPARD和PPARG的基因多态性表达，得出PPARG基因的数量与不稳定型心绞痛的发病率密切相关[17]。由此可见，通过对刺五加注射液及心绞痛核心交集靶点的分析，刺五加注射液可通过调解上述靶点发挥对心绞痛的治疗作用。

通过对GO和KEGG富集分析结果表示，刺五加注射液治疗心绞痛可能主要作用于IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、脂质与动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)、高级糖基化终末产物–受体(AGE-RAGE)信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、核因子kappa B信号通路(NF-kappa B signaling pathway)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)对细胞炎症等相关信号通路有关。IL-17通路在人体的炎症反应和免疫功能发挥重要作用，IL17是有T (TH17)细胞分泌的促炎症细胞因子，在促进炎症反应进而对冠心病患者的治疗中发挥着重要作用[18]-[20]。研究指出炎症生物标志物NF-κB和TNF-α对心绞痛具有诊断性，并指出动脉粥样硬化的严重程度与心绞痛患者相关[21] [22]。众所周知，糖尿病及其并发症是心血管疾病的重要危险因素，也是当今糖尿病死亡率的重要原因，糖尿病患者的心脏管理应进一步加强。林紫薇等[23]指出枳实薤白桂枝汤在发挥诱导的大鼠心肌梗死与保护心脏功能，减轻心肌损伤和炎症，其机制可能与下调TNFR1的基因表达，抑制TNF/NF-κB通路有关。

李自青等[24]指出通过生物信息学分析Toll样受体信号通路与冠心病存在密切联系，而TLRs家族可能是冠心病防治的重要靶点。由此可见，刺五加注射液可通过上述通路进而阻止心绞痛进一步发展。分子对接结果验证了刺五加注射液主要化合物与核心靶点的结合能力，尤以刺五加注射液皂苷B、刺五加注射液叶苷C1、刺五加注射液皂苷D2、刺五加注射液叶苷D1、刺五加注射液苷L与TNF，IL6靶点结合能力最强，这说明刺五加注射液对机体免疫，炎症和损伤方面拥有较强调控能力。

综上所述，刺五加注射液治疗心绞痛的过程中主要作用于TNF、IL6、NFKB1、HIF-1A等核心靶点，调节IL-17、脂质与动脉粥样硬化等信号通路从而发挥治疗冠心病心绞痛的作用，尽管我们已经通过网络药理学对刺五加注射液治疗冠心病心绞痛进行了深入的研究，但仍有许多方面值得进一步探索。随着生物信息学和系统生物学技术的不断发展，我们可以进一步完善药物靶点预测、药物作用机制和药效评价等方面的研究，随着研究的不断深入，我们相信刺五加注射液在治疗冠心病心绞痛中的潜力和价值将得到更充分的发掘和应用。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。

参考文献