1. 引言

由于穿膜肽(CPPs)自身或者通过与配体相结合的方式能够穿透细胞膜并传递活性分子，最近得到了理论和实验研究者越来越多的关注 [1] [2] [3] 。短链氨基酸通常具有很高的阳离子性和亲水性，与其他肽(如转录反式激活因子肽(TAT)或多溶素)相结合，可以更有效地穿透细胞膜 [4] 。由于富含精氨酸的肽能够促进生物活性分子进入细胞，该特性使它们有望成为实现药物传递的代表，因此研究聚精氨酸肽的输运机制是非常必要的。这些年来，科研工作者在实验和理论上做了很多有关抗菌肽转运的工作。例如有研究报道，通过微胞饮吸收可以内化富精氨酸肽 [5] 。一些实验结果也表明，增加对大脑磷脂层的渗透可以诱导反胶束的形成 [6] 。尽管科学家研究了多种穿膜肽，但富精氨酸肽穿膜的潜在机制仍不很清楚，进入细胞的确切途径仍未完全地研究透彻。

除了穿膜肽的特性，细胞膜的特性在穿透过程中也起着非常重要的作用。之前的一些研究认为生物膜是对称的 [7] ，然而大部分的真核细胞膜是非对称的。比如，人类红细胞磷脂双分子层的外层是由卵磷脂、鞘磷脂、糖脂组成，而内层则由磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸组成 [8] [9] 。这样的非对称磷脂膜可以影响生物行为，比如巨噬细胞的识别 [10] 。因此我们认为深入研究穿膜肽对非对称磷脂双分子层的穿透是十分必要的。相较于其他穿膜肽而言，聚精氨酸肽具有更高的穿透效率，因此一直是研究的焦点。Li等人 [11] 的研究表明多聚精氨酸肽能够通过协作的方式携带纳米颗粒渗透到非对称膜。最近在研究纳米颗粒和生物膜的相互作用时，粗粒化分子动力学模拟已成为一个强大且不可缺少的工具 [12] [13] [14] 。本研究中我们将使用这种方法研究R9抗菌肽的浓度和膜的不对称程度对转运机制的影响，从分子水平上阐释多肽与非对称膜相互作用的机制，为药物传递提供了一些理论指导。

2. 模型和方法

相较于全原子分子动力学模拟而言，粗粒化分子动力学具有更大的空间和时间尺度，因此我们使用粗粒化分子动力学方法探究穿膜肽与生物细胞膜的相互作用机理 [15] [16] 。本文中，我们将使用Martini粗粒化力场研究聚精氨酸的转运过程 [17] 。该力场定义了四种粒子类型，即极性(P)、非极性(N)、近极性(C)、带电(Q)。根据氢键能力，在每一种主要类型中又存在着相应的子类型，并可用一或两个字母表示，即给体(d)、受体(a)、给受体(da)、非给受体(o)。用数字来表示极性的程度(从1到5分别代表着低极性到高极性)。需要特别说明的是，由于粗粒化力场中平滑能量势垒的存在，系统所经历的有效时间比模拟采样时间要长4倍 [4] 。因此本工作我们用有效时间进行模拟。

接下来我们将构建模拟所需要的模型。首先，从网址http://crdd.osdd.net/raghava/cppsite/下载原子结构的R9抗菌肽 [18] 。然后，将Martini力场拓展到蛋白质的脚本martinize.py，并把全原子结构的抗菌肽转化为粗粒化的抗菌肽 [19] 。然后，将这个粗粒化的结构在水溶液中模拟100 ns。每一个精氨酸被映射成三种珠子，分别是：主链珠子(P5)和侧链珠子(Qo和Qd)，见图1。由于侧链中Qd类型的珠子含有一个正电荷，因此整个R9抗菌肽就有9个正电荷。聚精氨酸抗菌肽的成键相互作用参数包括：键长、键角和二面角的势能函数；非键相互作用参数包括范德华相互作用势能函数和静电相互作用势能函数。Takechi等人 [20] 发现当69个精氨酸与阴离子磷脂大单层囊泡相互作用时，这种短链聚精氨酸保持其圈型结构不变。由于R9抗菌肽是个只有9个精氨酸的肽，所以我们没必要考虑模拟过程中其螺旋结构的改变。

为了模拟抗菌肽和接近人体真实存在的磷脂膜相互作用的机制，我们采用非对称的人红细胞膜模型 [8] 。这种膜包含三种类型的磷脂分子，分别是：二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)。图2展示了基于Martini粗粒化力场，将全原子的磷脂分子映射成粗粒化的模型 [21] 。对于DPPC、DPPE、DPPS这三种膜的磷脂胆碱基依次粗粒转化成了Qo、Qd和P5类型的珠子。磷脂分子的磷酸基、甘油基、碳尾分别用Qa，Na和C1这三种类型的珠子表示。在Martini粗粒化力场下，脂质成键相互作用和非键相互作用的表达式和参数见表1。我们仿照人红细胞膜构建了磷脂膜，在磷脂双分子层的外层有DPPC和DPPE两种磷脂分子，它们的比例是9:1；在磷脂双分子的内层，有DPPC、DPPE和DPPS三种磷脂分子，它们的比例是3:5:2。

首先用insane.py [22] 脚本构建一个尺寸为12.5 × 12.5 × 18 nm³的立方体盒子，其中包含510个粗粒化磷脂分子和将近11,000个水珠子。为了防止在低温环境下Martini水溶液的虚假凝结，又加入1000个“防冻剂”(WF)水珠子。磷脂分子的数目和之前研究的磷脂数目512很相近 [23] 。为保持系统的中性，加入相应数目的钠离子，详细情况见表2。随后对体系进行200 ns的NPT平衡，时间步长设置为20 fs。通过V-rescale热浴方法将温度控制在323 K，弛豫时间0.1 ps；用Parrinello-Rahman方法将压强控制在1 bar，时间常数设置为12 ps。范德瓦尔斯(VDW)相互作用的截断半径是1.2 nm。对于静电相互作用，采用的是Particle Mesh Ewald (PME)方法 [24] ，介电常数设置为15。之后将R9抗菌肽和上面模拟好的磷脂膜组合在一起，重新构建一个立方体盒子(图2)。如图所示，R9抗菌肽和磷脂膜的质量中心在Z轴方向上的距离是4 nm。在该方向上，模拟盒子被固定在18 nm。随后我们采用最陡下降法对体系进行能量最小化。然后进行一个200 ns的平衡模拟。在平衡模拟中，为了更好的平衡水和离子，我们用一个1000 KJ mol⁻¹nm⁻²的

表1. Martini粗粒化力场下磷脂模型的详细参数

表2. 模拟体系

力限制住抗菌肽和磷脂膜的运动。最后，移除对抗菌肽和磷脂膜的限制，在NPT条件下进行一个长达1000 ns的模拟。模拟采用的时间步长也是20 fs，邻区列表每10 ps更新一次。我们用Berendsen热浴和压力耦合方法将温度和压强分别控制在323 K和1 bar [25] 。范德瓦尔斯相互作用的截断距离是1.2 nm，Lennard-Jones (L-J)势在两体距离0.9 nm和1.2 nm之间平滑地变换到0。用PME方法控制静电相互作用，库仑势在两体距离0 nm和1.2 nm之间变换到0。所有的模拟都是用GROMACS 4.6.7软件包来进行的 [26] ，结果用视觉分子动力学(VMD)软件包来展示 [27] 。为了保证结果的可靠性，所有的模拟都至少模拟3遍。

3. 结果和讨论

我们用不同浓度R9抗菌肽和无张力非对称膜来研究抗菌肽和细胞膜相互作用机制。用抗菌肽与磷脂分子的数量比来指示肽浓度，分别是：1:510；3:510；5:510；7:510。研究发现，一个和三个R9抗菌肽只是吸附在细胞膜表面，并未穿透到细胞膜内(见图3)，这是抗菌肽在低浓度下无法越过细胞膜中高能垒的缘故。Li等人 [11] 研究了单个R9抗菌肽与磷脂膜相互作用的平均力势(PME)，阐述了出现类似现象的原因。

为了更全面地理解R9抗菌肽和磷脂膜之间相互作用机制，我们计算了磷脂基团与R9抗菌肽之间的径向分布函数(RDFs)，如图4所示，红色线代表磷脂的磷酸基团与抗菌肽的函数关系，绿色线代表磷脂的甘油基团与抗菌肽的函数关系，黑色线代表磷脂的胆碱基团与抗菌肽的函数关系。RDFs说明，R9抗菌肽并未停留在磷脂分子表面，而是紧紧地与磷脂头基吸附在一起。以上结果是带正电荷的R9抗菌肽与带负电荷的磷酸基团相互吸引，同时排斥带正电荷的胆碱基团所导致的。He等人 [28] 的研究也发现了穿膜肽吸附在磷脂双分子层外层的现象。

为了研究高浓度下R9抗菌肽与磷脂膜的相互作用，我们将肽的个数分别增加到5个和7个。模拟结果显示，随着抗菌肽浓度增加，穿过磷脂膜的肽也相应增加(见表2)。图5中，我们展示了5个抗菌肽与磷脂膜相互作用的过程。如图所示，127 ns时，其中一个R9抗菌肽与磷脂膜表面的磷脂头基相互作用，并诱导膜向下弯曲；144 ns时，磷脂膜上形成了一个环形孔(如图6(a))，紧接着抗菌肽沿着此通道进入膜内；147 ns后，抗菌肽完全穿过磷脂膜，并在151 ns左右移动到膜底部，随后环形孔消失。借助抗菌肽穿透磷脂膜的过程，我们可以给出抗菌肽的穿膜机制示意图(图6(b))。从磷脂膜顶部和侧面观察，水分子并未沿此孔道穿过细胞膜，可以推断环形孔具有亲水性。7个R9抗菌肽与磷脂膜的相互作用过程如图7所示。由于抗菌肽的浓度增加，22 ns时，其中一个抗菌肽快速诱导磷脂膜向下弯曲，随后抗菌肽按上面的描述模式进入细胞膜；38 ns时，第一个抗菌肽已完全穿过磷脂膜；41 ns时，第二个抗菌肽开始与磷脂膜头基相互作用。这段时间内，环形孔一直存在；54 ns后，第二个抗菌肽也穿过磷脂膜，随后环形孔消失。模拟结果与之前的实验结果类似，富精氨酸肽穿膜后未对细胞膜产生永久性损伤 [29] 。在z轴方向上，抗菌肽和磷脂膜的质心距离随时间的变化进一步表明有多少抗菌肽穿过磷脂双分子层(如图8)。

高浓度下，R9抗菌肽可以穿透磷脂膜有两方面原因。第一个原因归结于体系中增强的静电相互作用。由于R9抗菌肽浓度升高，体系中存在更多的正电荷，从而增加了磷脂双分子层下层中DPPS膜与抗菌肽之间的静电吸引力。Tian等人 [8] 的研究也表明，对于负电性的生物膜与阳离子纳米颗粒的相互作用体系，静电吸引起着重要作用。另一个原因是抗菌肽的协同效应。Lee等人 [30] 也研究了PAMAM树形分子通过协同效应所诱导的磷脂膜弯曲，并给出了在弯曲区域穿透磷脂膜的现象。多个R9抗菌肽穿过磷脂膜也遵循协同效应。总而言之，高浓度下的协同效应和增强的静电相互作用能帮助R9抗菌肽越过高能垒，从而使其容易地跨过磷脂双分子层而进入细胞内部。

4. 结论

本文我们使用粗粒化分子动力学模拟方法探究了R9抗菌肽与非对称磷脂膜之间相互作用的机制。研究结果表明，由于高能垒存在，单个抗菌肽无法自发地越过能垒并穿过磷脂膜。然而，在多个抗菌肽与磷脂膜相互作用体系中，由于增强的静电相互作用和多个R9抗菌肽的协同效应，其中一个或两个抗菌肽能够越过能垒，并在非对称膜中形成环形的亲水性孔。随后，抗菌肽沿此孔道穿过磷脂膜。随着体系中抗菌肽浓度的增加，肽穿过磷脂膜的数量也相应增加，穿膜时间也提前了。该结论对于在分子水平上理

解抗菌肽与磷脂膜相互作用的机制有一定的借鉴意义，对于生物学中的药物设计和药物传递也有一定的参考价值。

基金项目

感谢国家自然科学基金(No. 11674198)，山东省泰山学者项目和山东省自然科学基金(No. ZR2014AM002)的资助。

参考文献