1. 引言

分光光度法是一种简单而科学的分析方法，既可应用于无机领域又可应用于有机领域，既可测定微量组分又可测定高含量，并容易实现多组分的联测，节能减排 [1] [2]。但由于干扰因素多且复杂，掩盖了它的真实规律，致使人们长期坚守比尔定律，而把它与光度法实际的不符，归咎于入射光的非单色性 [3] [4] [5] [6] [7]。在无法获得单色入射光的情况下，实际工作采用多个标准绘制“校准曲线” [8] [9] [10] [11] [12]，造成了光度法测定含量有限、实施程序繁杂、环境污染严重。实践证明，“精密度法则”，即“保持各影响因素对于同一测定系列各个样品影响的一致性”，可使各种影响因素对同一测定系列各个样品的干扰趋于一致，显示出光度法的真实规律，展现出它在分析化学中无可替代的功能。本文以钢铁中锰的测定为例，作详细介绍。

2. 实验部分

2.1. 主要仪器及试剂

分光光度计：721型，中国上海精密仪器仪表有限公司；硝酸溶液(体积比)：硝酸:水 = 1:4；硫–磷混酸(体积比)：硫酸:磷酸:水 = 1:1:2；过硫酸铵溶液(质量比)：5%过硫酸铵水溶液(现用现配)；硝酸银溶液(质量比)：1%硝酸银水溶液，1000 ml加20 ml硝酸；实验用水必须是蒸馏水；试剂均为分析纯。

2.2. 实验方法

严格遵循“精密度法则”，同一测定系列，由同一人在同一天平称取试样0.2000 g置于200 ml锥形瓶，加硝酸溶液30 ml，加热溶解，赶去氮化物。取下，流水冷却至室温。由同一人用同一100 ml容量瓶加水定容，作为样品“母液”。由同一人用同一10 ml刻度移液管，移取10 ml“母液”置于200 ml锥形瓶。由同一人用同一5 ml刻度移液管，分别加入硝酸银溶液、过硫酸铵溶液各5 ml。在80℃~100℃水浴中摇动加热40 s，取出，流水冷却至室温。30 min内，由同一人用同一1 cm比色皿，以水作参比，在520 nm不变动条件下测定 ${\text{MnO}}_4^{-}$ 吸光度。

3. 结果与讨论

3.1. “精密度法则”在光度法中的作用

实践证明，光度法测定中的人员、器械、物料、方法、环境都会严重影响它的测定结果，错乱光度法的真实规律。只有严格遵循“精密度法则”，即严格保持各干扰因素在同一测定系列各个样品(包括标准样品)的制备和测定中的同一性 [13]，才能显现光度法的真实规律。同时，它是正态分布理论在光度法中的具体体现，使光度法的样本测得值近似正态分布，不仅易于发现系统误差和统计离群值，保证了测定结果的可靠性，而且简化了结果的不确定度评定，确立了不确定度的测量模型。

3.2. 化学物质吸光规律

选取多个碳钢标准样品，在严格遵循“精密度法则”条件下，按照本文2.2的方法，测定 ${\text{MnO}}_4^{-}$ 的吸光度。测定结果列于表1。

根据表1数据，绘制锰的“校准曲线”(图1)。从图1可以看出，在入射光520 nm值域(0.10~0.86)内，所有样品的含量和吸光度的坐标点(C，A)都落在同一“校准曲线”上。曲线方程是“两点式”：

$\left(A_x-A_I\right)/\left(A_{II}-A_I\right)=\left(C_x-C_I\right)/\left(C_{II}-C_I\right)$ (1)

从图1可知，曲线的方程可以有如下形式：

$A_{II}-A_I=k\left(C_{II}-C_I\right)$ (2)

以吸光度改变量 $\Delta A$ 、含量改变量 $\Delta C$ 分别替代 $\left(A_{II}-A_I\right)$ 和 $\left(C_{II}-C_I\right)$，式(2)可简化为：

$\Delta A=k\Delta C$ (3)

式(3)表明，“在入射光值域内，化学物质的吸光度改变量 $\Delta A$ 与其相应的含量改变量 $\Delta C$ 成正比： $\Delta A=k\Delta C$ ”。我们称它为“化学物质吸光规律”。

“化学物质吸光规律”的存在，决定了入射光值域上、下限两个标准样品的坐标点连接线，即可作为样品含量的“测定线”，从而确立了“两标准光度法”，无需采用多个标准样品绘制“校准曲线”，因为“测定线”和“校准曲线”处于同一 $\Delta A=k\Delta C$ 的直线上。吸光度A_x对应的样品含量C_x，既可从“测定线”上查得，也可根据如下公式获得：

$C_x=\left[\left(A_x-A_t\right)\left(C_{II}-C_I\right)/\left(A_{II}-A_I\right)\right]+C_I$ (4)

比如，样品A_x = 0.428的相应含量，从“测定线”上查得是0.96%，将A_x = 0.428、A_I = 0.114、C_II = 2.02%、C_I = 0.19%、A_II = 0.860代入式(4)，得到的含量同样是0.96%：

$C_x=\left[\left(0.614\right)\left(1.83\right)/\left(0.746\right)\right]+0.19=0.770+0.19=0.96(\%)$

上述事实表明“测定线”与式(4)是等效的，它们都是“化学物质吸光规律”的具体体现。但“校准曲线”(“测定线”)却与比尔定律不符，比如，“测定线”上吸光度A_x = 0.428的相应含量是0.96%，而按照比尔定律，若以含量0.19%、吸光度0.114作标准，则A_x = 0.428的相应含量为0.71%；若以0.77%、吸光度0.350作标准，则其含量为0.94%；若以1.40%、吸光度0.608作标准，则其含量又为0.99%；若以2.02%、吸光度0.860作标准，又成为1.01%。可见，按照比尔定律，只有用含量与样品逼近的标准样品进行换算，如0.77%或1.40%，才可得到较为接近样品实际含量的结果，而以与样品含量相差较大的标准换算，则两者含量相差越大，得到样品结果的系统误差误差也越大，这是采用比尔定律造成测定结果带有系统误差的根本原因(见本文3.4中的实例)。所以，认为光度法在“校准曲线”范围内符合比尔定律的观点仍然是错误的。

“化学物质吸光规律”不仅使光度法的实际操作得以简化，更重要的是，它奠定了光度法测定各种含量的理论基础，因为 $\Delta A=k\Delta C$ 中的含量改变量 $\Delta C$，既可是痕量的改变量，也可是高含量的改变量。

3.3. “精密度法则”是正态分布理论在光度法中的具体体现

中心极限定理表明，如果受一系列独立因素影响的随机变量X_i的变化，对其总和的影响“都很微小”，则X_i的分布极限是正态分布 [14] [15]。也就是当 $n\to \infty$ 时，量值μ样本的测得值X_i是正态分布。尽管影响光度法的“人员、器械、物料、方法、环境”等因素千差万别，但只要在量值μ样本的各个观察值X_i的制备和测试过程，都严格遵循“精密度法则”，则各个观察值X_i就会“如出一模”，它们各自的变化对其总和的影响就必然“都很微小”，所以它们的“大样本( $n\to \infty$ )”就是正态分布。统计学又证明这时，n > 5的“小样本”近似正态分布，而且容量越大越近似正态分布 [16]。

3.4. “小样本”中系统误差的排除

实践证明，由于采用标准样品与被测样品含量的差异，按照比尔定律求得结果，常常含有系统误差。比如碳钢中锰的9个重复测定结果(%)：0.68、0.69、0.68、0.67、0.69、0.71、0.72、0.69、0.70，就含有系统误差。因为遵循“精密度法则”的样本测得值近似正态分布，也就是测得值以均值为中心近似均称分布。比如，表2“两标准光度法”锰、硅、磷的10个测得值 [17]，它们的分布都基本均称。而上述9个测得值，6个≥0.69，3个<0.69，分布明显不均称，表明有系统误差。根据“两标准光度法”会消除系统误差的事实，采用“两标准光度法”对其重新确定(%)：0.66、0.66、0.67、0.66、0.67、0.66、0.68、0.67、0.73，其中≥0.67的是5个，<0.67的是4个，基本均称。实践证明，不经过系统误差排除，测定结果常常会是错误的 [18]，本例排除前均值为0.69%，排除后为0.67%，两者显然不同。

3.5. “小样本”中统计离群值的排除

“小样本”测得值中常常存在异常数据，即统计离群值，它们会严重影响结果的可靠性。“小样本”近似正态分布，为发现统计离群值提供了条件。因为正态分布的样本均值 ${\bar{X}}^{\prime }$，会因测得值的不同而在极差中心的左右摆动，所以含最大残差E_R的测得值，必然处于极差R与0.5R之间。我们采用“折半法”，在n = 5~10的“小样本”中，对其测得值进行选择，使超出( ${\bar{X}}^{\prime }\pm E_R$ )的测得值，即为GB/T4883-2008中格拉布斯法的“统计离群值” [19]。经过大量统计归纳，我们确定E_R = 0.65R，即超出( ${\bar{X}}^{\prime }\pm 0.65R$ )的测得值，就是应剔除的统计离群值。上述3.4中不含系统误差的9个测得值(%)：0.66、0.66、0.67、0.66、0.67、0.66、0.68、0.67、0.73， ${\bar{X}}^{\prime }$ = 0.67%，R = 0.07%。它们的( ${\bar{X}}^{\prime }\pm 0.65R$ )区间：0.62%~0.72%，测得值0.73%超出了该区间，所以是个应当剔除的统计离群值。清除0.73%后 ${\bar{X}}^{\prime }$ = 0.67%既不含系统误差，也不含统计离群值，所以是可靠的。虽然清除0.73%前后的均值依然是0.67%，这并不表明这一清除没有必要，因为清除前的极差R = 0.07%，清除后的极差R = 0.02%。前者U₉₅ = 0.02%，测定结果为(0.67 ± 0.02)%，k_p = 2；后者U₉₅ = 0.01%，测定结果为(0.67 ± 0.01)%，k_p = 2。两个结果的不确定度差了一倍，表明只有排除了系统误差和统计离群值的结果才是真实可靠的。比如表2中“两标准光度法”锰、硅、磷的测得值，既排除了系统误差，同时又排除了统计离群值，所以它们才是真实可靠的 [17]。

实践证明，以( ${\bar{X}}^{\prime }\pm 0.65R$ )判断统计离群值是必要的，也是有效的。它简化了格拉布斯法的应用，对于保证检测结果的可靠性是极为实用的。

3.6. “增量光度法”的确立

基于系统误差可改变“两标准光度法”的吸光度而不改变其样品含量的事实，我们确立了微含量样品测定的“增量光度法”。比如，应用 ${\text{MnO}}_4^{-}$ 光度法对含锰量低于0.10%的铁粉样品X中锰的测定：选取含锰0.00%的纯铁粉B₁和含锰量0.96%的碳钢B₂，作为铁粉样品X锰测定的上、下限两个标准样品，并以含锰量0.96%的碳钢B₂作为锰测定系列的系统“增量”，实施铁粉样品X中锰的测定。

按照本文2.2方法称取试样0.2000 g，制成各试样的“母液”100 ml。用同一10 ml刻度移液管分别移取各“母液”10 ml，分别置于3个200 ml的锥形瓶中。再用同一10 ml刻度移液管，向3个锥形瓶中分别加入B₂“母液”10 ml作为测定系列的系统“增量”。再用同一5 ml刻度移液管向3个锥形瓶中分别加入硝酸银溶液、过硫酸铵溶液各5 ml。然后按照本文2.2方法显色、测定各自 ${\text{MnO}}_4^{-}$ 的吸光度。

铁粉X、纯铁粉B₁、碳钢B₂三个样品的吸光度分别为0.310、0.300、0.560。纯铁粉B₁锰含量为0.00%，标准B₂在体积20 ml时锰含量为0.96%，在体积为30 ml时锰含量则为0.64%。以B₁、B₂两个的坐标点(0.00%，0.300)、(0.64%，0.560)连接线作为样品X锰的“测定线”，查得铁粉X吸光度0.310相应的锰含量为0.035%。

实践证明，“增量光度法”比“标准加入法”更简便而切合实际 [20]。

3.7. 光度法测定结果的不确定度

从本文3.3可知，遵循“精密度法则”的光度法样本测定，与JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》 [21] (以下简称“规范”)的重复性测量一致。“规范”之4.3.2.6指出，被测量的n次重复测量的平均值 ${\bar{X}}^{\prime }$ 的A类标准不确定度为：

$u\left({\bar{X}}^{\prime }\right)=S/\sqrt{n}$ (5)

统计学指出， $S/\sqrt{n}$ 是测定“小样本”平均值 ${\bar{X}}^{\prime }$ 的实验标准差，它表明 ${\bar{X}}^{\prime }$ 落在 $\mu \pm 2S/\sqrt{n}$ 和 $\mu \pm 3S/\sqrt{n}$ 两个区间的概率分别为0.9545%和0.9973% [22]。“规范”之4.5指出，这两个包含区间的半宽度就分别是 ${\bar{X}}^{\prime }$ 的两个扩展不确定度：

$U_{95}=2S/\sqrt{n},k_p=2$ (6)

$U_{99}=3S/\sqrt{n},k_p=3$ (7)

S是样本观察值X_i的标准差。根据“规范”4.3.2.6之要求，“小样本”容量应取10。这时“小样本”必然近似正态分布，所以X₁₀的S可按照极差法 $S=R/C$ 评估。n = 10，则 $C\approx 3$， $S=R/3$。将 $S=R/3$ 代入式(6)、式(7)，即可得到不确定度的测量模型：

$U_{95}=0.67R/\sqrt{n},k_p=2$ (8)

$U_{99}=R/\sqrt{n},k_p=3$ (9)

测量模型式(8)、式(9)表明，“小样本”均值 ${\bar{X}}^{\prime }$ 的不确定度与样本极差成正比，与样本容量的平方根成反比。实践证明，它们是“规范”要求的“在任何给定被测量的测量值实际可达到的最小测量不确定度”，比“合成法”评定结果简明而切合实际 [18] [23]。

3.8. 不确定度与允许误差的统一

实验室的日常检测结果都有允许误差要求，而当前国家对实验室测量结果又有了不确定度要求 [24]，所以应当使两者统一，光度法的不确定度测量模型具备了这样的条件。因为无论不同实验室的“人员、器械、物料、方法、环境”多么不同，只要各自都遵循“精密度法则”，检测相同化学物质的“人员、器械、物料、方法、环境”检测能力必然是确定的，同一化学物质的同一个测定系列，就只能有一个的正常极差R (超常极差会在排除统计离群值中被清除)，所以各自样本的不确定度就只决定于各自样本的容量。如果设定各自样本测定的允许误差为 $\Delta$，它就是该物质日常检测结果的“约定不确定度”。已知容量为n“小样本”的不确定度是U₉₅和U₉₉，则“约定不确定度” $\Delta$ 的“小样本”容量n_X就应分别为：

$n_X=n{\left(U_{95}/\Delta \right)}^2\left(取整数\right)$ (10)

$n_X=n{\left(U_{99}/\Delta \right)}^2\left(取整数\right)$ (11)

比如，表2碳钢中锰、硅、磷的10次测得值，锰的允许误差 $\Delta =\pm 0.04\%$，不确定度U₉₅ = 0.008%；硅的允许误差 $\Delta =\pm 0.03\%$，不确定度U₉₅ = 0.006%；磷的允许误差 $\Delta =\pm 0.05\%$，不确定度U₉₅ = 0.001%。根据式(10)，它们的n_X都为0.4 (计算过程省略)，即都是一次测得值X_i就可满足允许误差要求。它们测定结果的允许误差和不确定度就统一是 $\Delta$。测得结果既可以允许误差方式表达为： $\left(X_i\pm \Delta \right)\%$，也可以不确定度方式表达为： $\left(X_i\pm \Delta \right)\%$，k_p = 2。实际表2中锰、硅、磷的10个测得值中的每一个，与它们的标准值之间的误差，都没有超出各自的允许误差 $\Delta$，标准值也没有超出它包含概率0.95区间的半宽度 $\Delta$。 $\Delta$ 比表2中的U₉₅值大，因为在遵循“精密度法则”条件下，样本容量愈小，不确定度就愈大。

式(10)、(11)对于常规检测的指导作用，证明了光度法不确定度模型的可靠性、普适性，“合成法”的评定结果就没有这种特性。也表明了“精密度法则”使光度法样本测得值正态分布的重要，因为没有样本的正态分布，就没有光度法不确定度的测量模型。

4. 结语

实践证明，“精密度法则”是光度法的基础技术。它不仅可使各种因素对同一测定系列的干扰趋于一致，显示出了光度法的真实规律，确立了“两标准光度法”，奠定了光度法测定各种含量的理论基础，改变了传统观念；而且它是正态分布理论在光度法中的具体体现，样本测得值呈正态分布。不仅易于发现系统误差和统计离群值，保证了测定结果的可靠性，而且简化了结果的不确定度评定，满足了JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》的各项要求，极有推广应用价值。

参考文献

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